호스트 리간드에서 금속 반응 유전자 및 금속 취득의 특성화를 위한 Neisseria 임질의 금속 제한 성장
Summary
우리는 여기에서 금속 섭취에 대한 유전자의 발현을 용이하게하기 위해 금속 제한 액체 배지에서 Neisseria 임질의 성장을위한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 이 조건에서 성장한 임노코커스의 표현형을 특성화하기 위하여 다운스트림 실험을 개략적으로 설명합니다. 이들 방법은 다른 박테리아에서 금속 반응성 유전자의 특성화에 적합하도록 적응될 수 있다.
Abstract
철과 아연과 같은 미량 금속은 유전자 조절, 촉매 및 단백질 구조를 포함한 원핵 경핵 공정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 중요한 영양소입니다. 호스트에 의한 금속 격리는 종종 박테리아에 대한 금속 한계로 이어집니다. 이 제한은 박테리아가 금속 한정된 환경을 극복하기 위하여 박테리아를 허용하는 그의 단백질 제품을 박테리아 유전자 발현을 유도합니다. 그러한 유전자의 특성화는 도전적입니다. 박테리아는 전술한 유전자의 발현을 달성하는 데 도움이 되는 금속 프로필을 유지하면서 세균 성장을 허용하기 위해 영양 금속에 충분한 접근을 허용하는 세심하게 준비된 매체에서 성장해야 합니다. 따라서 이러한 금속의 농도에 대해 섬세한 균형을 설정해야 합니다. Neisseria 임질과같은 영양학적으로 까다로운 유기체를 키우는 것은 인간 숙주에서만 생존하기 위해 진화했으며, 복잡성의 추가 수준을 추가합니다. 여기서, 우리는 임질 성장 및 원하는 유전자 발현을 허용하기에 충분한 정의된 금속 제한 배지의 제조를 기술한다. 이 방법을 사용하면 조사관이 원하지 않는 공급원으로부터 철분과 아연을 킬레이트하는 동시에 철분이나 아연의 정의된 공급원으로 매체를 보충할 수 있으며, 이 방법은 그 준비도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 금속 조절 된 임코칼 유전자의 단백질 제품을 특성화하는 데 도움이되는이 매체를 활용하는 세 가지 실험을 설명합니다.
Introduction
Neisseria 임질은 일반적인 성병 임질을 일으키는 원인이 됩니다. 감염 동안, 병원성 Neisseria는 박테리아가 인간 숙주1,2,3에의한 금속 제한 노력을 극복 할 수 있도록 금속 반응 유전자의 레퍼토리를 표현한다. 철과 아연과 같은 미량 금속은 촉매 부위의 효소에 결합하고, 산화 배원 반응에 참여하고, 다양한단백질의구조적 요인으로 많은 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다4,5. 금속 이한 조건에서, 금속 반응성 좌위는 억압되고 그 결과 단백질은 이 양분의 취득을 도울 수 있습니다. 이 유전자와 단백질의 특성화는 조사자에게 독특한 기술적 도전을 제시합니다. 금속 이온은 그들의 네이티브 loci에서 이 유전자의 전사를 유도하기 위하여 박테리아에서 보류되어야 합니다, 그러나 금속 적재매체에서 이온의 효과적인 킬레이트화는 낙관하기 어려울 수 있습니다. 분말 성분의 원천물과 고유의 로트 대 로트 변이6의 다른 금속 프로파일은 풍부한 배지에서 특정 금속을 제거하는 데 필요한 킬레이터의 양이 화학 물질 재고가 대체됨에 따라 단일 실험실 내에서 여러 위치, 성분 공급 업체 및 시간이 지남에 따라 달라질 수 있음을 의미합니다.
이러한 과제를 회피하기 위해, 우리는 용액에서 미량 금속을 제거하기 위해 준비하는 동안 Chelex-100 수지로 처리되는 정의된 배지의 제조를 설명합니다. 이 배지는 인간 숙주 외부에서 배양하기 어려운 임균의 성장을 허용하기에 충분한 영양밀도이며, 조사자가 자신의 정의된 공급원과 농도를 추가하여 특정 금속 프로파일을 도입할 수 있도록 합니다. 금속. 고갈된 배지에 원하는 금속의 제어 된 추가 백 방법은 실험 일관성을 증가시키고 수원 및 화학 로트 번호와 같은 요인에 관계없이 강력하고 복제 가능한 실험을 허용합니다. 또한 이 미디어는 사소한 수정만으로 액체 또는 고체로 배포할 수 있으므로 매우 다재다능합니다.
이 매체의 유용성을 입증하기 위하여는, 우리는 임골 성장을 위한 그것의 사용을 위한 프로토콜을 설명하고 금속 반응하는 Neisseria 유전자를 특성화하기 위하여 3개의 성공적인 실험을 기술합니다. 첫째, 우리는 금속 고갈 또는 보충 배양물에서 임노코칼 전체 세포 용해제를 준비하고 금속 반응성 로시에서 단백질 생산의 다양한 수준을 보여줍니다. 그런 다음, 특정하고 사용 가능한 아연 공급원의 보충에 의해 임코칼 성장이 조절되는 아연 제한 성장 분석법의 개요를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 각각의 금속 함유 리간드에 결합금속 반응 표면 수용체를 발현전체 임노코칼 세포를 보여주는 결합 성 세포를 보여줍니다. 이 수용체의 성공적인 표면 프리젠 테이션은 금속 고갈 매체의 성장을 필요로한다.
본 프로토콜은 Neisseria 임질을위해 특별히 최적화되었지만, 수많은 다른 세균성 병원체는감염시 금속 획득 전략을 7, 그래서 이 프로토콜은 다른 박테리아에서 금속 항상성의 연구에 적응될 수 있다. 다른 박테리아에서 사용하기 위해 이 매체와 이러한 실험 프로토콜을 최적화하려면 다른 박테리아가 임균과 약간 다른 금속 요구 사항을 가질 수 있기 때문에 Chelex-100으로 금속 킬레이트화기 농도 및/또는 처리 시간을 약간 수정해야 합니다. 철과 아연은 기재된 조사에 대한 관심의 주요 금속이지만, 다른 금속(예를 들어, 망간)은 Neisseria8,9,10,11,12를포함하는 박테리아에 대해 중요한 것으로 입증되었다. 더욱이, 진핵 세포 배양 작업에서 금속 특성화에 대해서도 유사한 방법이 기술되었으며, 이는 또한 고려될 수 있다. 13세
Protocol
Representative Results
Discussion
성장 매체는 미생물 학적 연구에서 다양한 역할을합니다. 특수 미디어는 다양한 유형의 연구를 위한 선택, 농축 및 기타 다양한 응용 분야에 사용됩니다. 이러한 응용 중 하나는 금속 반응 유전자의 유도이며, 이는 일반적으로 특정 금속 이온을 표적으로 하는 특정 킬레이터를 첨가하여 수행됩니다. 이러한 방법은 다양한 미량 금속에 필요한 킬레이트화의 양이 독특한 금속 프로파일을 함유하는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R01 AI125421, R01 AI127793 및 U19 AI144182에 의해 지원되었다. 글을 쓰는 저자는 이 방법의 교정 및 검토에 기여한 모든 실험실 구성원에게 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
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