De store bekkengangene inneholder parasympatiske og sympatiske nevroner som innervate bekkenorganer. Her beskriver vi en disseksjonsmetode og gir skjemaer for identifisering av disse ganglia og deres tilhørende nerver. Disse metodene kan brukes til eksperimentell manipulering av disse ganglia in vivo eller fjerning post-mortem for videre studier.
De bilaterale store bekkengangene (MPG; synonym, bekkenganglia) er den primære kilden til postganglioniske sympatiske og parasympatiske nevroner som innerver pelvic organer av gnagere; den funksjonelt tilsvarende strukturen hos mennesker er den dårligere hypogastriske plexus. De store bekkengangene gir også ruten der lumbal og sakrale sensoriske aksoner når bekkenorganene. Disse komplekse, blandede ganglia kan være utfordrende å identifisere og dissekere for videre eksperimentell studie av normale autonome mekanismer eller å etablere prekliniske modeller av sykdom, skade eller visceral smerte. Her beskriver vi en protokoll for å få tilgang til og visualisere disse ganglia og deres tilknyttede nervekanaler. Vi gir denne protokollen med skjemaer for både mannlige og hunnrotter, da ganglionstørrelse og landemerker for identifisering varierer mellom kjønnene. Protokollen beskriver fjerning av ganglion for in vitro studier, men denne metoden kan integreres i en kirurgisk gjenopprettingsprotokoll for eksperimentelle intervensjoner (f.eks nerveknuse, nervereseksjon) eller for kartlegging av nevronale kretser (f.eks. ved mikroinjeksjon av nevrale sporstoffer). Vi demonstrerer også de primære strukturene i ganglion og dens tilhørende nerver umiddelbart etter disseksjon og etter immunohistokjemisk farging.
Rotten er en av de best karakteriserte artene som brukes i studien av bekkenorganets fysiologi og anatomi. Mens gode ressurser finnes for beskrivelser av disse organene1,2, gir de vanligvis ikke informasjon om relaterte nevrale strukturer eller gjør det ved utilstrekkelig oppløsning for å veilede en eksperimentell studie. Som beskrevet lenger under, organiseringen av de autonome ganglia som regulerer bekken organfunksjon er ganske forskjellig fra resten av det autonome nervesystemet, noe som gjør det vanskelig å nøyaktig infer bekken innervering funksjoner fra nevroanatomisk informasjon tilgjengelig for andre autonome ganglia. Denne mangelen på ressurser for å veilede forskere som kommer inn i dette området, kan ha bremset forskningen på neural regulering av bekkenorganer. Her beskriver vi protokoller for å få tilgang til denne regionen av nervesystemet for videre in vitro studier eller eksperimentell intervensjon.
De bilaterale store bekkengangene (MPG; synonymer: bekkenganglia; paracervical ganglia [kvinne]; Frankenhäuser’s ganglion [kvinne]) er den primære kilden til postganglionic sympatiske og parasympatiske nevroner innervating bekken organer av gnagere; den dårligere hypogastriske plexus består av tilsvarende nevronal struktur hos mennesker3,4,5,6. Sensoriske projeksjoner fra lumbal og sakraldorsalrotganglia er også på reise via MPG for å nå bekkenorganene. Derfor er det viktig å forstå nevrale kretser og biologi av MPG for prekliniske studier på en myriade av kliniske forhold knyttet til utvikling og voksen funksjon av bekkenorganer. Flere gode beskrivelser av gnager MPG har blitt publisert7,8, men vår erfaring er at generelt disse beskrivelsene ikke alltid gir tilstrekkelig veiledning for praktisk å praktisk talt informere en eksperimentell disseksjon eller manipulering av disse strukturene når utvinning av dyret er nødvendig. Videre fokuserer de fleste MPG-studier på hannrotter. Hos hunnrotter er MPG mindre9 og har forskjellige anatomiske landemerker, og krever derfor en tydelig skreddersydd guide til visualisering og disseksjon.
Sympatiske og parasympatiske veier er preget av deres anatomi, spesielt plasseringen av deres preganglionic nevroner, med sympatiske veier som har preganglionic nevroner i thoraco-lumbar ryggmargen og parasympatiske preganglionic nevroner som ligger i hjernestammen (kranial nerve projeksjoner) og sakraal ryggmargen. I de fleste andre regioner av det autonome systemet, deres mål ganglion nevroner ligger i distinkte sympatiske eller parasympatiske ganglia. Mpg er imidlertid uvanlig i å være blandet sympatisk-parasympatiske ganglia, og derfor i en makroskopisk skala er steder av konvergens fra preganglionic aksoner av både thoraco-lumbal og sakrale spinal regioner. Vi har derfor inkludert i våre protokoller plasseringen og beskrivelsen av disse primære nervekanalene som forbinder hver spinalregion med MPG, noe som letter eksperimentell analyse eller separat manipulering av disse nevrale komponentene. Vi merker oss også for lesere som spesifikt sammenligner disse ganglia på tvers av arter, at i gnagere er spinal preganglionic nevroner som er “funksjonelt sakral”, for eksempel aktive og kreves under micturition, avføring og penile ereksjon, ligger på spinalnivåer L6-S1 i stedet for utelukkende i sakrale segmenter10; Likeledes L6 og S1 dorsal rot ganglia gi de store “sakrale” sensoriske innspill til bekken organer. Hos gnagere er sensorisk e-blåog preganglionic inngang fra mer rostral nevrale kretser konsentrert i spinalnivåer L1 og L210.
Her beskriver vi en protokoll for å få tilgang til MPG og deres tilknyttede nervekanaler hos hann- og hunnrotter, og støtter dette med skjemaer for å illustrere spesifikke landemerker. Denne protokollen veileder kirurgisk tilgang til disse strukturene i en eksperimentell sammenheng med å fjerne vevet for in vitro-studier, for eksempel isolere MPG-nevroner for molekylær karakterisering eller primærkultur. Det kan også tilpasses MPG fjerning etter intracardiac perfusjon med fikseringsmiddel, selv om dette er en vanskeligere disseksjon fordi nevrale vev blir vanskeligere å visualisere når tilstøtende vev er blottet for blod. Denne protokollen kan også integreres i en kirurgisk setting for eksperimentell inngrep av disse nerveveiene (f.eks. nervereseksjon, mikroinjeksjon av nevrale sporere). Disse typer desseksjoner blir stadig viktigere for det voksende feltet av bioelektronisk medisin, hvor nye mål og tilnærminger for neuromodulasjon for å behandle kliniske tilstander i bekkenvisera utvikles11. Vi presenterer hele protokollen først for hannrotter, deretter en replikering av protokollen skreddersydd spesielt for hunnrotter.
Nevrale kontroll av bekkenorganene formidles av komplekse veier, inkludert somatiske, parasympatiske, sympatiske og viscerale sensoriske komponenter14,15,16,17. De fleste av disse banene stammer fra eller passerer gjennom MPG. Disseksjonsprotokollene som er skissert her, gir en introduksjon til MPG-anatomi, de relaterte tilhørende nervene og nærliggende makroskopiske anatomiske landemerker; sistnevnte er illustrert av anatomiske skjemaer. Andre tilnærminger til MPG disseksjon kan også være vellykket, men vi finner den som er beskrevet her for å være robust og egnet for en forsker ny til dette området av nervesystemet.
De mest kritiske aspektene ved protokollen er riktig identifisering av hver stor nerve og fullstendig fjerning av MPG vev. Med nøye visning og håndtering av vevet kan MPG vev fjernes for anatomiske, molekylære og elektrofysiologiske in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollen kan også tilpasses in vivo eksperimentell manipulasjon23,24,25, bemerker at i dette tilfellet må det tas stor forsiktighet for å minimere kontakt med de primære nervene forbundet med ganglion eller skade nærliggende vaskulatur. Hvis eksperimentet krever selektiv denervation ved avbrudd av en eller flere nerver, anbefales det å ligate den avkuttede nerven for å forhindre reinnervation og forvirrende av analyser. Denne disseksjonprotokollen kan også brukes for musen, hvor det også er en MPG med sammenlignbar funksjon26,27,28.
For nevroanatomiske studier oppnås den beste bevaringen av antigener og vevsstruktur ved å dissekere MPG fra et bedøvet dyr som har blitt perfundert transkaralt med histologisk fikseringsmiddel som passer til eksperimentet29; Imidlertid er identifisering av ganglion og nervestrukturer vanskeligere etter denne prosessen, da vevsfargen går tapt. Det anbefales å bli dyktig i å identifisere og dissekere ganglion fra ikke-perfunderte dyr før du prøver denne disseksjonen etter perfusjon. Likeledes anbefales det å først bli dyktig i disseksjon hos menn fordi for dyr av tilsvarende alder og kroppsstørrelse er MPG og tilhørende nerver mye mindre hos kvinner.
For å validere at vevet fjernet er faktisk MPG, anbefales forskeren først å sjekke plasseringen og funksjonene til hver primærnerve. Mange dissektorer finner bekkennerven og cavernøs nerve den enkleste å identifisere in situ; hypogastriske og tilbehørsnerver er mer delikate og vanskeligere å skille fra det omkringliggende vevet. Hvis disse nervene ikke lenger er tilgjengelige på grunn av problemer under disseksjon, eller hvis det er usikkerhet om deres struktur, anbefales det at innledende MPG-desseksjoner er preget av konvensjonell histologi (for å bekrefte tilstedeværelsen av nevronale cellelegemer8) og for det andre med immunohistochemistry (for å identifisere at både kolinerge og noradrenerge nevroner er tilstede30,31) (Figur 3). For å validere riktig identifisering av de store nervene, blir de cavernøse nervene lett identifisert av deres høye tetthet av nevronale cellelegemer i sin første del nær MPG; de fleste av disse nevronene uttrykker markører for kolinerge, nitrerge nevroner32,33. Bekkenet, hypogastriske og tilbehørsnerver har svært få nevronale cellelegemer34.
Det er flere vanlige fallgruver i å utføre denne disseksjonen. Hvis nybegynnere dissektorer har problemer med å finne noen av de store nervene eller MPG, oppfordres de til å gå tilbake til trinnene som beskriver de viktigste landemerkene. Det er svært vanlig å bli så fokusert på å finne mikrostrukturer at man mister oversikten over makroskopisk kontekst. Vanligvis beveger nybegynnere enten seg for langt rostral i sitt disseksjonssted eller forblir for “overfladiske”-dvs., for nær ventralåpningen av magen, i stedet for å undersøke dypere (dvs. mer dorsal) strukturer. Et vanlig problem under disseksjon er skade på vaskulaturen under disseksjon. Hvis blødningen starter, hold forsiktig en bomullsspiss applikator over kilden til blødningen stopper, skyll deretter området liberalt med saltvann før du recommencing disseksjon. Det er mulig mpg vil ikke være brukbar for eksperimenter hvis forurenset med for mye blod eller hvis disseksjon er forsinket for lenge mens du venter på blødning å stoppe. En annen vanlig disseksjonsfeil er skade på kapselen i prostata kjertelen som betydelig svekker MPG-visualiseringog fjerning. Denne kapselen er en veldig delikat struktur som lett punkteres mens du fjerner fettet fra prostataens sidevegg, selv om du bare bruker en bomullstippet applikator. Til slutt blir de viktigste nervene forbundet med MPG lett skadet under prosessen med å identifisere hver og deretter under fjerning av MPG. Dissektorer oppfordres til å utvikle en rutine der hver nerve er isolert i sin tur, i en bestemt rekkefølge, slik at det er mindre mulighet for forvirring under de siste trinnene av ganglion fjerning.
Denne disseksjonen søkte ikke å spore hver av komponentene i tilbehørsnervene til bestemte organer, eller for å identifisere hver av de mange mikrogangliaene som ligger på ulike punkter mellom bekkengangene og bekkenorganene8. Disse er ganske vanskelig å visualisere in vivo uten å bruke spesifikke flekker; Imidlertid kan de fjernes ved å følge hver av nervekanalene mot organene, og utnytte spesifikke nevrale flekker post hoc for å bestemme ganglion plassering. Disse mikroganglia, selv om bestående av bare liten brøkdel av nevronal befolkningen i forhold til MPG, kan gi bestemte typer innspill til organer som de er mest nært plassert. Vi merker oss her en begrensning i feltet at verken disse mikroganglia eller mange av de små nervekanalene som forlater MPG for å reise til bekkenorganer, men har bredt akseptert navn. Videre er en tilsvarende detaljert studie av mikroganglia ennå ikke utført hos hunnrotter.
Oppsummert gir protokollen og skjemaene som tilbys her forskere verktøy for å studere de primære strukturene som gir den autonome nervetilførselen til bekkenorganene, samt de store perifere ledningene av sensoriske nerver fra lumbosakral dorsalrot ganglia som reiser via MPG til bekkenorganer.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Office of the Director, National Institutes of Health, Stimulere perifer aktivitet for å lindre forhold (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Dr. Bertrands fellesskap i Dr. Keasts laboratorium ble finansiert av: Universitetssykehuset i Nîmes, Fakultet for medisin i Montpellier-Nîmes, Foreningen Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinair Francophone d’UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) og People Programme (Marie Curie Actions) i EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under REA-avtale Ingen PCOFUND-GA-2013-609102, gjennom PRESTIGE koordinert av Campus Frankrike.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |