리소리피드 함유 온도 민감성 리포좀의 미세유체 생산
Summary
이 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서 미세유체 장치를 사용하여 열감도 리포좀을 준비하기 위한 최적화된 파라미터를 제시합니다. 이것은 또한 리포솜으로 독소루비신과 인도시아닌 녹색의 공동 캡슐화와 통제/트리거된 약물 방출을 위한 독소루비신의 광열 트리거 방출을 허용합니다.
Abstract
제시된 프로토콜은 독소루비신(DOX)과 같은 화학치료제를 적재할 수 있는 저온 민감성 리포좀(LTSL)의 고처리량 연속 제제를 가능하게 한다. 이를 달성하기 위해, 에타놀릭 지질 혼합물 및 황산암모늄 용액을 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(SHM) 미세유체 장치에 주입한다. 용액은 SHM에 의해 빠르게 혼합되어 리포좀 자체 조립을 위한 균일한 용매 환경을 제공합니다. 수집된 리포솜은 먼저 어닐링된 다음 투석하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 암모늄 황산염 pH 그라데이션은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 외부 용액의 완충 교환을 통해 확립된다. DOX는 높은 캡슐화 효율(> 80%)으로 리포솜에 원격으로 로드됩니다. 얻어진 리포솜은 Z 평균 직경 100 nm의 크기에서 균일하다. 그들은 온화한 고열 (42 °C)의 존재에 캡슐화 된 DOX의 온도 트리거 버스트 방출이 가능합니다. 인도시아닌 녹색 (ICG) 또한 근적외선 레이저 트리거 DOX 방출을 위한 리포솜으로 공동 로드될 수 있습니다. 미세 유체 접근 방식은 LtSL의 높은 처리량, 재현성 및 확장 가능한 준비를 보장합니다.
Introduction
LTSL 제제는 화학요법 약물 인 독소루비신 (DOX)을 전달하기 위해 개발된 임상적으로 관련된 리포좀 생성물이며 임상적으로 달성 가능한 경증 고열 (T °41 °C)에서 효율적인 파열 약물 방출을 허용합니다1. LTSL 제제는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-인산콜린(DPPC), 리졸리피드 1-스테아로일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(MSPC; M은 “모노”) 및 PEGylated 지질 1,2-distearoyl-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000)를의미합니다. 상 전이 온도(Tm °41°C)에 도달하면, 리소지질 및 DSPE-PEG2000은 함께 막 기공의 형성을 용이하게 하고, 약물의 파열 방출을초래한다 2. LTSLs의 준비는 주로 대량 하향식 접근, 즉 지질 막 수화 및 압출을 사용합니다. 동일한 특성과 임상 적용을 위한 충분한 수량으로 대량 배치를 재현가능하게 준비하는 것은 여전히 어려운 일입니다3.
미세 유체학은 튜닝 가능한 나노 입자 크기, 재현성 및 확장성을 제공하는 리포솜을 준비하기위한 새로운 기술입니다3. 제조 파라미터가 최적화되면, 처리량은 벤치 스케일3,4,5에서준비된 것과 동일한 특성으로 병렬화로 확장할 수 있습니다. 기존의 벌크 기술에 비해 미세 유체의 주요 장점은 소형화를 통해 공간과 공간에서 높은 제어성을 갖춘 작은 액체 볼륨을 처리할 수 있는 능력으로, 연속적이고 자동화된 방식으로 작동하면서 더 빠른 최적화를 가능하게 한다는 것입니다6. 미세 유체 장치를 사용하는 리포좀의 생산은 상향식 나노 침전 접근법에 의해 달성되며, 이는 압출 및 초음파 처리와 같은균질화 공정이 불필요하기 때문에 더 많은 시간과 에너지 효율이 있다. 전형적으로, 지질(및 소수성 페이로드)의 유기 용액(예를 들어 에탄올)은 혼화가능한 비용매(예를 들어 물과 친수성 페이로드)와 혼합된다. 유기 용매가 비 용매와 혼합됨에 따라 지질에 대한 용해도가 감소됩니다. 지질 농도는 결국 강수 과정이 트리거되는 임계 농도에 도달7. 지질의 Nanocipitates 결국 크기에서 성장 하 고 리포솜에 가까운. 리포솜의 크기 및 균질성을 지배하는 주요 인자는 비용매와 용매 사이의 비율(즉, 수성-유기 유량 비율; FRR) 및 지질을 리포좀으로 자가 조립하는 동안 용매 환경의 균질성8.
미세 유체학적에서의 효율적인 유체 혼합은 따라서 균질 리포좀의 제조에 필수적이며, 믹서의 다양한 디자인은 다른 응용 분야에서 사용되어 왔다9. 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(SHM)는 낮은 희석 계수로 높은 처리량(mL/min 범위)을 가능하게 하는 새로운 세대의 패시브 믹서 중 하나를 나타냅니다. 이것은 전통적인 미세 유체 유체 역학 혼합 장치8,10보다우수합니다. SHM은 빠르게 혼란 대류9,11에의해 유체를 혼합 헤링본 홈을 패턴했다. SHM의 짧은 혼합 시간 척도(< 5 ms, 10-100 ms의 전형적인 응집 시간 척도 미만)는 균일한 용매 환경에서 지질 자가 조립이 발생하도록 허용하며, 균일한 크기 분포를 가진 나노입자를 생성한다 3,12.
미세 유체학을 가진 LTSL의 준비는, 그러나, 콜레스테롤8의부족 때문에 전통적인 리포좀 제형에 비해 간단하지 않으며, 지질 이중층이 에탄올 유도 된 간 디지털화에 취약하지 않은13,14,15. 지금까지 리포좀의 미세 유체 생산 동안 잔류 에탄올 의 효과는 잘 이해되지 않았다. 보고된 제형의 대다수는 LTSLs와 달리 포화 상태이고 콜레스테롤이 없는 상호 디지털화(콜레스테롤 또는 불포화 지질함유)(16)에본질적으로 내성이 있습니다.
본 원에 제시된 프로토콜은 SHM을 사용하여 온도 트리거 방출 약물 전달을 위한 LTSL을 준비합니다. 제시된 방법에서, 우리는 동적 광 산란(DLS)에 의해 마이크로유체 제조 된 LTSL이 나노 크기 (100 nm) 및 균일 (분산도 < 0.2)되도록 보장하였다. 더욱이, 우리는 LTSL 지질 이중층의 무결성의 검증으로서 막막 암모늄 황산염 그라데이션 방법(원격 로딩이라고도함)(17)을 사용하여 DOX를 캡슐화하였다. DOX의 원격 로딩은 높은 캡슐화 효율(EE)을 달성하기 위해 pH 구배를 유지하기 위해 리포좀이 필요하며, 이는 그대로 지질 이중층 없이는 일어날 가능성이 낮다. 이러한 제시된 방법에서, 전형적인 미세유체 리포솜 제제 프로토콜과 는 별개로, 원격 로딩 기능을 가능하게 하기 위해 에탄올이 제거되기 전에 어닐링 단계가 요구되고; 즉, 지질 이중층의 무결성을 회복한다.
앞서 언급했듯이, 친수성 및 소수성 페이로드는 또한 LTSL 형성 중에 페이로드를 동시에 캡슐화하기 위한 초기 솔루션에 도입될 수 있습니다. 개념 증명으로, indocyanine 녹색 (ICG), FDA 승인 근적외선 형광 염료, 또한 유망한 광열 제, 초기 지질 혼합물에 도입 하 고 성공적으로 LSLs에 공동 로드. 808 nm 레이저는 DOX/ICG 로드 LTSL을 조사하여 5분 이내에 광열 가열 트리거 된 DOX 의 버스트 방출을 성공적으로 유도하는 데 사용됩니다.
모든 계측기와 재료는 시판되고 즉시 사용할 수 있으며 사용자 정의할 필요 없이 사용할 수 있습니다. LSL을 공식화하기 위한 모든 파라미터가 최적화되었기 때문에, 이 프로토콜에 따라 미세 유체에 대한 사전 지식이 없는 연구원들은 열민감성 약물 전달 시스템의 기초가 되는 LTSL을 준비할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 엇갈인된 헤링본 마이크로믹서(SHM)를 사용하여 저온 민감성 리포좀(LTSL)의 제조를 설명한다. LTSL10 제제는 임상적으로 달성 가능한 42°C의 고열 온도에서 5분 이내에 독소루비신의 온도 트리거 버스트 방출을 가능하게 합니다. 인도시아닌 녹색(ICG)은 또한 DOX의 방출을 촉발한 광열 가열을 위해 공동 로드될 수 있다. 이 방법은 에 의존: (i) SHM11에서에탄올과 황산?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전립선 암 영국 (CDF-12-002 펠로우십) 및 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC) (EP/M008657/1) 자금을 주셔서 감사합니다.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
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