성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화
Summary
섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.
Abstract
상해에 응하여 심장 섬유증은 상처 치유에 생리적인 반응입니다. 섬유증을 완화하는 섬유아세포 아류형을 연구하고 표적으로 하기 위한 노력이 이루어졌다. 그러나, 섬유아세포 연구는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지를 확인하기 위해 보편적으로 허용되는 섬유아세포 마커의 부족으로 인해 방해받고 있다. 섬유아세포는 이질적인 세포 집단으로, 분리하고 특성화하기 가 어렵습니다. 제시된 프로토콜은 부상과 부상당한 마우스 하트에서 섬유 아세포와 근섬유 아세포를 풍부하게하는 세 가지 방법을 설명합니다. 섬유아세포를 분리하기 위해 표준적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용하면 항상성 및 섬유변조에서의 역할에 대한 연구가 가능해질 것입니다.
Introduction
심장 섬유 아세포, 중간 엽 기원의 세포는 항상성 동안 심장 아키텍처의 유지 보수 이외에 심장의 전기 전도 및 기계적 힘을 유지하는 데 중요한 역할을합니다1. 상해 다음, 이 세포는 활성화, 확장, 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 생산2. 많은 전임상 연구는 부상당한 심혼의 구조적 무결성을 유지하는 중요한3 세포 조절제로서 섬유아세포를 밝혀3 뿐만 아니라 ECM 단백질의 확인되지 않은 생산 및 침착을 담당하는 주요 이펙터 세포, 뻣뻣한 흉터 형성 및 심부전의 결과로4. 섬유아세포는 세포의 이질적인 그룹으로, 프로 섬유성 부적응 특성으로부터 회복 기능을 해부하는 것이 어렵습니다. 최근, 심근 손상 에 따른 두 개의 뚜렷한 섬유아세포 아형의 기능적 이질성이 정의되어, 상이한 섬유아세포 아형을 분리하고 상처 치유에서 그들의 역할을 연구할 가능성을 나타낸다5.
순수한 섬유아세포 집단을 얻는 것은 수리및 섬유증에 있는 그들의 기능적인 역할을 delineating에서 결정적입니다. 그러나, 다른 세포 모형을 인식하는 다중 섬유아세포 마커의 존재는 실질적으로 순수한 섬유아세포 인구를 격리하는 것을 도전하게합니다 6. 몇몇 우아한 연구 결과는 부상과 부상당한 심근에서 심장 섬유아세포를 격리하는 영리한 쪽을 고안했습니다. 섬유아세포 농축의 가장 대중적이고 잘 확립된 방법은 효소 조직 소화7에따른 선택적 접착을 통해서이다.
부가적으로, 세포 표면 항원을 기초로 한 섬유아세포의 형광 활성화 세포 선별(FACS)은8에성공적으로 기술되었다. 연구에서, 효소 소화 에 이어, 중간 엽 세포는 계보 음성으로 분류되었다 (린 : Ter119–CD45–CD31–) 및 gp38 양성 (gp38+) 마우스 하트에서. Gp38+ve 세포는 col1α1 및 기타 중간엽 마커의 그들의 공동 발현에 기초하여 섬유아세포로 확인되었다. 대부분의 조직 소화는 페트리 접시에서 심실을 해부한 후에 완료되지만, 최근 연구는 섬유아세포9를포함하는 근세포 및 비근세포등을 분리하기 위해 좌심실의 직접 바늘 효소 관류의 사용을 조사하였다. 섬유아세포는 이 경우 선택적 부착에 의해 분리되었다.
이 프로토콜은 세 가지 방법을 사용하여 섬유아세포의 격리 및 농축을 설명합니다. 첫 번째는 효소 소화 다음 섬유 아세포의 선택적 접착을 포함 하는 이미 설립 된 방법. 두 번째 방법은 주로 근섬유 아세포를 발현하는 상해 유발 알파 평활근을 분리하는 데 사용된다. 세 번째 방법은 조혈 및 내피 세포의 효소 소화 심장 세포 현탁액의 순차적 자기 고갈을 포함한다. 고갈 다음, 섬유아세포/근섬유아세포는 자기 구슬을 사용하여 항원 MEFSK4의 존재에 기초하여 단리된다. 최근, MEFSK4는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지에 존재하는 항원으로서 기술되어 섬유아세포 식별 및 격리에 적합한 마커가 되고 있다. 당연히 여기에 설명된 모든 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 따라서 유량 분석, 면역 염색 및 반정량 적 실시간 PCR에 의해 단리된 세포 집단의 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 그러나, 이러한 방법론은 에 확장 될 수 있고, 추가 마커는 중요한 실험을 위한 섬유아세포 및 myofibroblast 인구를 이용하기 전에 그밖 오염인구를 제외하기 위하여 추가될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
섬유아세포는 다양한 마커 세트로 확인된 이종 세포 그룹입니다. 섬유아세포를 식별하는 데 사용된 단백질 마커는 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2), 피브로넥틴, 비멘틴, 콜라겐 I 및 III, 및 Thy115,,16,,17,,18,,19,,20이다. 비멘틴은 손상되지 않은 정지성…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 αSMA-GFP 마우스에 대한 박사 이보 Kalajzic 감사하고 싶어. 이 간행물에 보고된 연구는 국립 보건원의 국립 의학 연구소에 의해 지원되었다 (NIH) 수상 번호 R01GM118300 (S.S.), NIH의 생물 의학 이미징 및 생명 공학의 국립 연구소 수상 번호 R21EB019509 (P.P.Y.) 및 수상 번호 17SDG33630187 (S.S.)에 따라 미국 심장 협회의 과학자 개발 보조금. 유세포 분석 분석은 밴더빌트 잉그람 암 센터(P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터(DK058404)가 지원하는 VUMC 유동 세포분석 공유 리소스에서 수행되었습니다.
Materials
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
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