एक मानव म्यूकोसल लिम्फोइड ऊतक में पूर्व वीवो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि सक्रियण पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आंशिक सर्जिकल टॉन्सिलेक्टॉमी से गुजर रहे स्वस्थ मनुष्यों से टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को आसानी से कैसे संसाधित और संस्कृति से जोड़ा जाए, म्यूकोसल ऊतकों में वायरल संक्रमण की नकल करें।
Abstract
म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतकों (माल्ट) से अलग कोशिकाओं का अध्ययन म्यूकोसल प्रतिरक्षा से जुड़ी विकृतियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की समझ की अनुमति देता है, क्योंकि वे ऊतक में मेजबान-रोगजनक बातचीत मॉडल कर सकते हैं। जबकि ऊतकों से प्राप्त अलग कोशिकाओं पहले सेल संस्कृति मॉडल थे, उनके उपयोग की उपेक्षा की गई है क्योंकि ऊतक प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम समझाते हैं कि स्वस्थ मानव टॉन्सिल से टॉन्सिलर मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (टीएमसी) को सक्रियण पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने, म्यूकोसल ऊतकों में वायरल संक्रमण की नकल करने के लिए आसानी से कैसे संसाधित और संस्कृति का अध्ययन किया जाए। टॉन्सिल से टीएमसी का अलगाव जल्दी होता है, क्योंकि टॉन्सिल में बमुश्किल कोई एपिथेलियम होता है और सभी प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के अरबों तक उपज होती है। यह विधि रक्त से परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के उपयोग के समान इम्यूनोसे, क्यूपीसीआर, माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री आदि सहित कई तकनीकों का उपयोग करके साइटोकिन उत्पादन का पता लगाने की अनुमति देती है। इसके अलावा, टीएमसी पीबीएमसी की तुलना में दवा परीक्षण के प्रति उच्च संवेदनशीलता दिखाते हैं, जिसे भविष्य की विषाक्तता के लिए विचार करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, पूर्व वीवो टीएमसी संस्कृतियां एक आसान और सुलभ म्यूकोसल मॉडल हैं।
Introduction
मानव अंगों पर अध्ययन पहुंच के साथ-साथ स्पष्ट नैतिक कारणों के कारण प्रतिबंधित हैं । हालांकि, वे मानव जीव विज्ञान की जटिलता को पूरी तरह से समझने के लिए आवश्यक हैं। अलग कोशिकाओं की संस्कृतियों (प्राथमिक संस्कृतियों या सेल लाइनों) उनकी उपलब्धता के कारण सेल जीव विज्ञान के अध्ययन में एक मानक प्रणाली है । जबकि अलग सेल संस्कृतियों बकाया खोजों की अनुमति दी है, सेल लाइनों के उपयोग के करीब जांच पर आ गया है क्योंकि वे पूरी तरह से वीवो अंग जीव विज्ञान में नकल नहीं करते । हालांकि, त्रि-आयामी कोशिकाओं या ऊतक एक्सप्लांट की संस्कृति अत्यधिक जटिल है4,,5,,6। दरअसल, ऊतक या अंग का एक टुकड़ा अत्यधिक विषम है क्योंकि इसकी कोशिका संरचना ऊतक में स्थानीयकरण के आधार पर अलग होती है। इस प्रकार, ऊतक ब्लॉकों का उपयोग करने के लिए कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जिससे बड़ी संख्या में दानदाताओं या रोगियों की आवश्यकता होती है।
म्यूकोसा से जुड़े लिम्फोइड ऊतक (माल्ट) संरचनात्मक रूप से लिम्फ नोड्स के समान होते हैं, लेकिन अद्वितीय कार्य होते हैं, क्योंकि उनकी मुख्य भूमिका म्यूकोसल प्रतिरक्षा7को विनियमित करना है। लिम्फ नोड्स के विपरीत, जो आमतौर पर ऊतकों से कुछ दूरी पर स्थित होते हैं, माल्ट आम तौर पर म्यूकोसल ऊतक के एपिथेलियम के तुरंत नीचे स्थित होते हैं। हिस्टोलॉजिकल रूप से, वे मुख्य रूप से बी और टी कोशिकाओं की उच्च सांद्रता से बने होते हैं, लेकिन एंटीजन-पेश कोशिकाएं जैसे मैक्रोफेज और डेंड्रिटिक कोशिकाएं भी होती हैं। माल्ट मानव शरीर में लिम्फोइड ऊतक का लगभग 50% बनता है। माल्ट को उनके स्थान के आधार पर नौ समूहों में विभाजित किया जाता है: GALT (आंत-), बाल्ट (ब्रोंकस-), NALT (नाक-), CALT (कंजक्टिव), लालीटी (कंठ-), नमक (त्वचा-), VALT (vulvo-), ओ-माल्ट (संगठित), और डी-माल्ट (विसरित) । ओ-माल्ट मुख्य रूप से वाल्देयर के टॉन्सिलर रिंग के टॉन्सिल से बना है और यह सबसे सुलभ माल्ट8,,9है। दरअसल, ओरोफेरिन्स में स्थित टॉन्सिल पाचन और श्वसन तंत्र (संभावित) आक्रामक सूक्ष्मजीवों10से रक्षा करने वाली प्रमुख बाधा का गठन करते हैं । इसके अलावा, टॉन्सिल को एक महीन स्तरीकृत स्क्वैमस गैर-केराटिनाइजिंग एपिथेलियम द्वारा कवर किया जाता है, जो रक्त वाहिकाओं, नसों और लिम्फाटिक्स युक्त कनेक्टिव ऊतक के कैप्सूल द्वारा समर्थित होता है, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं11,,12तक आसान पहुंच प्रदान करता है। इसके अलावा, टॉन्सिलेक्टॉमी, टॉन्सिल को हटाने का शल्य चिकित्सा कार्य, नींद से अस्त-व्यस्त श्वास लेने वाले बच्चों पर किया जाने वाला एक आम प्रक्रिया है, जिससे टॉन्सिल शारीरिक सेटिंग्स में आसानी से उपलब्ध ऊतक13 बन जाते हैं।
टॉन्सिल म्यूकोसल प्रतिरक्षा से जुड़ी विकृतियों में प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रिया के अध्ययन की अनुमति देते हैं। दरअसल, एचआईवी संक्रमण में, क्योंकि टॉन्सिल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उच्च एकाग्रता से बना होते हैं, वे वायरल प्रतिकृति का मुख्य लक्ष्य होते हैं, लेकिन संचलन14, 15,15में बड़ी मात्रा में साइटोकिन्स का उत्पादन भी करते हैं। स्थिर राज्यों में, जन्मजात कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी टॉन्सिल सहित विभिन्न म्यूकोसल ऊतकों में मौजूद होती है, लेकिन रक्त से अनिवार्य रूप से अनुपस्थित होती है।
इस प्रकार, टॉन्सिल (टीएमसी) से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं पीबीएमएमसी की तुलना में अधिक प्रासंगिक और जटिल मॉडल हैं और अधिक गहन प्रश्नों का उत्तर दे सकती हैं। दूसरी ओर, ऊतक एक्सप्लांट का उपयोग जटिल हो सकता है और हमेशा जन्मजात प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए प्रासंगिक नहीं हो सकता है। इस प्रकार, हमने टीएमसीएस 16 का उपयोग करके म्यूकोसल प्रतिरक्षा सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडलस्थापित किया। यहां, हम ताजा मानव टॉन्सिल से टीएमसी के कुशल अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि पूर्व वीवो अध्ययनों के लिए अपनी अखंडता रखते हुए बड़ी संख्या में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली की अनुमति देती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव टॉन्सिल म्यूकोसल इंटरफेस पर जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत और शारीरिक पूर्व वीवो मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि वे एक माध्यमिक लिम्फोइड अंग की भूमिका ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे सुर ले सिडा एट लेस हेपेटिट्स एएनआरएस (जे-पी) द्वारा समर्थित किया गया था। एच) प्रयोगों और नायब फैलोशिप (AAP २०१७ १६६) के लिए । एन. एस फैलोशिप के लिए ANRS से समर्थन स्वीकार (AAP २०१६ 1), फैलोशिप के लिए यूरोपीय आणविक जीव विज्ञान संगठन EMBO (LT ८३४ २०१७), स्टार्टअप फंडिंग प्रोग्राम “बॉस्टीन” उल्म विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय (LSBN.0147) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1) ।
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
