Generation af en menneskelig iPSC-baseret blod-hjerne barrierchip

Summary

Blod – hjerne barrieren (BBB) er en multicellulær neurovaskulær enhed stramt regulere hjernen homøostase. Ved at kombinere menneskelige iPSCs og organ-on-chip teknologier, har vi genereret en personlig BBB chip, egnet til sygdom modellering og CNS narkotika penetrability forudsigelser. En detaljeret protokol er beskrevet for produktion og drift af BBB-chippen.

Abstract

Blodhjernebarrieren (BBB) er dannet af neurovaskulære enheder (NVM), der beskytter centralnervesystemet (CNS) fra en række faktorer, der findes i blodet, der kan forstyrre sarte hjernefunktion. BBB er derfor en væsentlig hindring for leveringen af terapeutiske lægemidler til CNS. Akkumulere nde beviser tyder på, at BBB spiller en central rolle i starten og progression af neurologiske sygdomme. Således er der et enormt behov for en BBB model, der kan forudsige penetration af CNS-målrettede lægemidler samt belyse BBB’s rolle i sundhed og sygdom.

Vi har for nylig kombineret organ-on-chip og induceret pluripotente stamceller (iPSC) teknologier til at generere en BBB chip fuldt personlig til mennesker. Denne nye platform viser cellulære, molekylære og fysiologiske egenskaber, der er egnede til forudsigelse af narkotika og molekyle transport på tværs af den menneskelige BBB. Desuden har vi ved hjælp af patientspecifikke BBB-chips genereret modeller af neurologiske sygdomme og vist potentialet for personlig prædiktiv medicinapplikationer. Forudsat her er en detaljeret protokol, der viser, hvordan man genererer iPSC-afledte BBB-chips, begyndende med differentiering af iPSC-afledte hjernemikrovaskulære endotelceller (iBMECs) og resulterer i blandede neurale kulturer, der indeholder neurale stamlitter, differentierede neuroner og astrocytter. Også beskrevet er en procedure for såning celler i organchip og dyrkning af BBB chips under kontrolleret laminar flow. Endelig gives detaljerede beskrivelser af BBB-spånanalyser, herunder permecellulære permeabilitetsanalyser til vurdering af lægemiddel- og molekylepermeabilitet samt immuncytokemiske metoder til bestemmelse af sammensætningen af celletyper i chippen.

Introduction

BBB er en meget selektiv barriere, der adskiller CNS fra det cirkulerende blod. Det beskytter kritiske hjernefunktioner fra potentielt forstyrrende stoffer, faktorer, og xenobiotika samtidig tillader tilstrømning en næringsstoffer og andre metabolitter, der kræves for at opretholde hjernen homøostase¹. BBB er en multicellulær NVU, hvor pericytter, astrocyt endfeet, og neuronale processer direkte kontakt hjernen mikrovaskulære endotelceller (BMECs). Disse interaktioner gør det muligt for BMECs at danne specialiserede barriereegenskaber , der understøttes af tætte og klæbende vejkryds^2,3. Dannelsen af denne barriere begrænser paracellulær passage af molekyler, men det indeholder polariserede transportører til aktivt at transportere molekyler ind i CNS eller tilbage i blodet¹. På grund af disse unikke barriere egenskaber, BBB udgør en væsentlig hindring for levering af biofarmaceutiske lægemidler i hjernen, og det anslås, at mindre end 5% af FDA-godkendte små molekyler kan nå CNS⁴.

Dyremodeller har været meget anvendt til at studere BBB penetrance og de molekylære mekanismer, der er involveret i BBB udvikling⁵. Mens dyremodeller trofast repræsenterer det komplekse flercellede in vivo-miljø, udelukker forskelle i bbb-transportørers udtryk og aktivitet samt substratspecificitet på tværs af arter ofte nøjagtig ekstrapolering af dyredata til mennesker⁶. Således er menneskebaserede modeller afgørende for at studere den menneskelige BBB og til brug i udviklingen af lægemidler, der er designet til at målrette CNS. Dette behov bliver endnu tydeligere med den stigende dominans af biologiske, menneskespecifikke lægemidler på lægemiddeludviklingsområdet. Akkumulere beviser tyder på, at en kompromitteret BBB er forbundet med en række alvorlige CNS lidelser, herunder hjernetumorer og neurologiske sygdomme^7,8,9. Menneskelige modeller, der trofast afspejler disse sygdomme, har potentiale til både 1) at identificere nye veje, der kunne målrettes mod udvikling af lægemidler og 2) forudsige CNS penetrance, hvilket reducerer tid og ressourcer i prækliniske undersøgelser og muligvis faldende fejlrate i kliniske forsøg.

In vitro-modeller er blevet bredt implementeret for at undersøge samspillet mellem BMECs og andre celler i NVU og gennemføre skærme for potentielle BBB-permeable lægemidler¹⁰. For at genskabe centrale aspekter af den menneskelige BBB skal in vitro-modeller ne udvise fysiologisk relevante egenskaber (dvs. lav paracellulær permeabilitet og fysiologisk relevant transendotelelektrisk resistens [TEER] på tværs af det endotelmonolag). Desuden skal in vitro-systemets molekylære profil omfatte udtryk for repræsentative funktionelle transportsystemer. Typisk er in vitro-modeller sammensat af endotelceller, der er co-kulturfremstillet på en semipermeable membran med kombinationer af andre NVU celler til at forbedre BBB egenskaber¹¹. Denne fremgangsmåde giver mulighed for enkel og relativt hurtig vurdering af barrierefunktionalitet og molekylepermeabilitet. Sådanne cellebaserede BBB-modeller kan etableres med animalske eller menneskelige cellekilder, herunder celler isoleret fra kirurgiske excisions eller udødeliggjorte BMEC linjer.

For nylig blev protokoller til differentiere menneskelige pluripotente celler i BMECs indført som en attraktiv kilde til in vitro menneskelige BBB modeller^12,13. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte BMECs (iBMECs) er meget skalerbare, demonstrere afgørende morfologiske og funktionelle egenskaber af den menneskelige BBB, og bære genetik af patienten. I kultur danner iBMECs et monolag, der udtrykker stramme krydsmarkører og viser in vivo-lignende stramme krydskomplekser. Disse celler udtrykker også BBB-markører, herunder BBB-glukosetransportøren, glukosetransportør1 (GLUT1). Vigtigt, og i modsætning til andre alternative cellekilder for humane BMECs, iBMECs erhverve barriere egenskaber med værdier så højt som dem, der måles i vivo^14,polarisere langs basolateralakse, og udtrykke funktionelle efflux pumper. Desuden glæder brugen af iPSC’er fra forskellige begge 1) sig over muligheden for at teste aspekter af BBB på en personlig medicinmåde, og 2) giver en fleksibel kilde til generering af yderligere celletyper af NVU. Generering af disse celler fra en isogen celle kilde til at skabe personlige BBB chips ville også støtte i forståelsen af inter individuelle forskelle i lægemiddelrespons, som er en væsentlig årsag til resistens eller kompromitteret respons på behandling observeret i kliniske undersøgelser.

Brug af iBMECs som monolag i en skål eller på en semi gennemtrængelig transwell indsats repræsenterer en kraftfuld tilgang til BBB modellering. Disse systemer har tendens til at være robuste, reproducerbare og omkostningseffektive. Desuden er funktionelle analyser som TEER og permeabilitet relativt enkle at udføre. Men, to-dimensionelle (2D) systemer undlader at opsummere 3D karakter in vivo væv, og de mangler de fysiologiske forskydning stress kræfter, der leveres af cirkulerende blod og blodlegemer. Dette begrænser det vaskulære endotheliums evne i disse modeller til at udvikle og vedligeholde iboende BBB-egenskaber og -funktioner.

Microengineered systemer foret med levende celler er blevet gennemført til at modellere forskellige organ funktionaliteter i et koncept kaldet organ-on-chips. Ved at genskabe in vivo-lignende flercellede arkitektur, vævsvæv grænseflader, fysisk-kemiske mikromiljøer, og vaskulær perfusion, disse mikromanipulerede platforme generere niveauer af væv og organ funktionalitet ikke muligt med konventionelle 2D-kultursystemer. De muliggør også høj opløsning, realtidsbilleddannelse og analyse af biokemiske, genetiske og metaboliske profiler svarende til levende celler i in vivovæv og organkontekst. Men en særlig udfordring af orgel-on-chip er, at design, fabrikation, og anvendelse af disse mikroengineered chips kræver specialiseret ingeniørekspertise, der normalt mangler i biologisk orienterede akademiske laboratorier.

Vi har for nylig kombineret iPSC og organ-on-chip teknologier til at generere en personlig BBB chip model^15,16. For at overvinde de beskrevne teknologiske udfordringer bruges den kommercielt tilgængelige Chip-S1 sammen med kulturmodulet, et instrument, der er designet til at automatisere vedligeholdelsen af chipsene på en enkel og robust måde (Emulate Inc.). BBB-chippen genskaber interaktioner mellem neurale og endotelceller og opnår fysiologisk relevante TEER-værdier, som måles ved specialfremstillede organchips med integrerede guldelektroder¹⁷. Derudover viser BBB-chippen lav paracellulær permeabilitet, reagerer på inflammatoriske signaler på organniveau, udtrykker aktive efflux-pumper og udviser prædiktiv transport af opløselige biomarkører og biofarmaceutiske produkter. Især, BBB chips genereret fra flere personer indfanger de forventede funktionelle forskelle mellem raske personer og patienter med neurologiske sygdomme¹⁵.

Nedenstående protokol beskriver en pålidelig, effektiv og reproducerbar metode til generering af humane iPSC-baserede BBB-chips under dynamiske flowforhold. Der gives vejledning om typen af analyser og slutpunktsanalyser, der kan udføres direkte i BBB-chippen eller fra prøvetagningsspildevand. Protokollen viser således spektret af teknikker, der kan anvendes til evaluering af biologiske og funktionelle egenskaber og reaktioner i en menneskerelevant model.

En kort beskrivelse af den iPSC-baserede BBB-chip findes her. Menneskelige iPSCs er oprindeligt differentieret og formeret i vævkultur kolber som fritflydende aggregater af neurale sår, betegnes EZ-kugler. Den øverste kanal af Chip-S1^16,18,19 er seedet med dissociated EZ-kugler, der danner “hjernen side” af chippen, som celler differentiere over 7 dage i en blandet kultur af neurale stamsygdomme celler (iNPCs), iAstrocytter, og iNeurons. Menneskelige iPSCs er også differentieret i vævskulturplader i iBMECs. Den nederste kanal af chippen er seedet med iBMECs at danne “blod side”, som de udvikler sig til at danne en endotelrør (Figur 1). Den porøse ekstracellulære matrix (ECM)-belagt membran, der adskiller de øverste og nederste kanaler 1) tillader dannelsen af celle-til-celle interaktioner mellem kanaler og 2) giver brugeren mulighed for at køre permeabilitet assays og billedceller i begge kanaler ved hjælp af en konventionel lys mikroskop.

Protocol

1. Generation af iPSC-afledte neurale stamceller celler (iNpS) Producere EZ-kugler fra iPSC kolonier som beskrevet nedenfor og som tidligere offentliggjort20,21,22. Kultur iPSC kolonier til sammenløb på kælderen membran matrix-belagt 6 brønd plader (0,5 mg / plade) i mTESR1 eller andre kommercielle medier (se Tabel over materialer). Fjern iPSC medium og erstatte med 2 ml EZ-sfær…

Representative Results

Figur 6A,B,C repræsenterer en BBB-chip, der er seedet med EZ-kugler på “hjernesiden” og iBMECs på “blodsiden”- bundlinjen. iBMECs var seedet først og fik lov til at vedhæfte natten over, hvorefter EZ-kugler var seedet. Chips blev derefter dyrket under statiske forhold med daglige medier udskiftning i syv dage. BBB-chippen blev derefter fastgjort ved hjælp af 4% PFA på RT i 10 min og vasket 3x med DPBS. Immuncytokemi blev udført på BBB-chippen ved hjælp af 1) nestin…

Discussion

Kombinationen af organ-on-chip-teknologi og iPSC-afledte celler i NVU lover nøjagtig modellering af den menneskelige BBB. Her giver vi en detaljeret protokol for enkel og robust anvendelse af den nyligt offentliggjorte iPSC-baserede BBB chip¹⁶. En oversigt over og timing af seeding paradigme er vist i figur 3. At opnå og vedligeholde barrierefunktioner, der er egnede til BBB-modellering, er det afgørende at generere et homogent iBMEC-monolag og bevare dets integrit…

Materials

Accutase	EMD Millipore	SCR005	Dissociation solution
B27	Gibco	12587010
Bfgf	Peprotech	100-18B
Chip-S1	Emulate Inc	Chip-S1	Organ-Chip
Collagen IV	Sigma	C5533
DAPI	Invitrogen	D3571
Dextran-FITC	Sigma	46944
DMEM: F12	Thermo Fisher Scientific	31330038
Donkey serum	Sigma	D9663
Emulate Reagent 1 (ER-1)	Emulate Inc	ER-1
Emulate Reagent 2 (ER-2)	Emulate Inc	ER-2
Fibronectin	Sigma	F1141
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako	Z0334
GLUT-1	Invitrogen	MA5-11315
Glutamax	Life Technologies	35050038	Glutamine supplement
hBDNF	Peprotech	450-02
KOSR	Thermo Fisher Scientific	10828028
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	354234	Basement membrane matrix
mTeSR1	StemCell Technologies, Inc.	85851
NEAA	Biological industries	01-340-1B
Nestin	Millipore	MAB353
NutriStem	Biological industries	05-100-1A	Alternate media
PECAM-1	Thermo Fisher Scientific	10333
Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP)	Biomedical Technologies	J64483AB
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
S100β	Abcam	ab6602
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	SCGP00525
Triton X-100	Sigma	X100
ZO-1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	33-9100
βIII-tubulin (Tuj1α)	Sigma	T8660
β-mercaptoethanol	Life Technologies	31350010