هنا ، نصف الترسيب المناعي للريبوسوم والحمض النووي الريبي المرتبط به من مجموعات مختارة من الخلايا الجرثومية الذكور الذكور البالغين باستخدام نظام RiboTag. التربية الاستراتيجية والتناهيال المناعة دقيق يؤدي إلى نتائج نظيفة، قابلة للاستنساخ التي تبلغ عن الترجمة الخلية الجرثومية وتوفير نظرة ثاقبة في آليات الظواهر المتحولة.
قياس الاختلافات في وفرة مرنا هو نهج كلاسيكي لفهم تأثير طفرة جينية معينة على فسيولوجيا الخلايا. ومع ذلك ، فإن توصيف الاختلافات في الترجمة (كل mRNAs المترجمة) يوفر طبقة إضافية من المعلومات المفيدة بشكل خاص عند محاولة فهم وظيفة الحمض النووي الريبي ينظم أو البروتينات الملزمة. وقد تم تطوير عدد من الطرق لتحقيق ذلك، بما في ذلك التنميط الريبوسوم وتحليل تعدد الاتجاهات. ومع ذلك، تحمل كلتا الطريقتين تحديات تقنية كبيرة ولا يمكن تطبيقها على مجموعات خلايا محددة داخل الأنسجة ما لم تقترن بأساليب فرز إضافية. وعلى النقيض من ذلك، فإن طريقة RiboTag هي بديل وراثي وفعال ومباشر تقنيًا يسمح بتحديد الحمض النووي الريبوي المرتبط من مجموعات خلايا محددة دون خطوات فرز إضافية، شريطة توفر برنامج تشغيل Cre محدد الخلية. تتكون هذه الطريقة من التربية لتوليد النماذج الوراثية، وجمع العينات، والهطول المناعي، وتحليلات الحمض النووي الريبي المصب. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه العملية في الخلايا الجرثومية الماوس الذكور الكبار متحولة لبروتين الحمض النووي الريبي ملزمة المطلوبة لخصوبة الذكور. ويولى اهتمام خاص لاعتبارات التربية مع التركيز على كفاءة إدارة المستعمرة وتوليد الخلفيات الوراثية الصحيحة والهطول المناعي من أجل الحد من الخلفية وتحسين الناتج. كما يتم تضمين مناقشة خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتجارب التأكيدية الإضافية والتطبيقات النهائية المحتملة. تمثل الأدوات الوراثية والبروتوكولات الجزيئية المقدمة طريقة قوية لوصف الحمض النووي الريبي المرتبط بالخلايا الريبية لتجمعات خلايا محددة في أنسجة معقدة أو في أنظمة تخزين وترجمة مرنا شاذة بهدف الإبلاغ عن الدوافع الجزيئية للأنماط الظاهرية المتحولة.
وقد ثبت تحليل وفرة الحمض النووي الريبي للخلية أو الأنسجة ، كما تم فحصها من قبل microarray أو تسلسل الحمض النووي الريبي ، أداة قوية لفهم الدوافع الجزيئية للأنماط الظاهرية المتحولة. ومع ذلك ، قد لا تبلغ أدوات التحليل غير المكتملة نسبيًا عن فسيولوجيا الخلية أو بروتيومها ، خاصة في الأنظمة التي يتم فيها تخزين العديد من المواد المرنازة قبل الترجمة مثل الخلايا العصبية والجرثومية. في هذه الأنظمة، قد يكون تحديد عدد الـ mRNAs الذي يتم ترجمته بنشاط إلى بروتين، أو ترجمة الخلية، مؤشرًا أفضل لحالة الخلية الفسيولوجية الفعلية1،2. على سبيل المثال، الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة من التنمية نسخ الحمض النووي الريبي التي يتم تخزينها للترجمة في وقت لاحق، مدفوعة إما عن طريق التنموية3 أو الإشارات الإشارات4. وتتمثل هذه العملية من خلال بروتامينات ترميز mRNAs، حيث يمكن الكشف عن نسخة مرنا قبل أيام من البروتين يتم1،2،5،6. وبالمثل ، تقوم الخلايا العصبية بتدوين الحمض النووي الريبي في النواة ونقله إلى أسفل محور عصبي ، كما هو الحال مع α-actin7. بالإضافة إلى أنظمة الخلايا المتخصصة هذه ، من غير المرجح أن تكون النسخ الثابتة الحالة مفيدة في النماذج التي تتأثر فيها تخزين الحمض النووي الريبي ، أو التكوين الحيوي الريبوسوم ، أو ترجمة مرنا. عوامل أخرى متعددة قد تؤثر أيضا على تجمع الحمض النووي الريبي ثابت في الخلية تشمل الاضمحلال مرنا ونشاط البروتينات الملزمة الجيش الملكي النيبالي. وفي هذه الحالات، من المرجح أن تسفر الأدوات القوية لتحليل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم أو الحمض النووي الريبي تحت الترجمة النشطة عن نتائج ذات صلة بيولوجياً.
وتحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير عدة أساليب لتحديد الرسائل المرتبطة بالريسوم أو التي تترجم بنشاط. وقد استخدمت التنميط المتعدد، الذي يوفر لقطة من النصوص المرتبطة الريبوسوم، لعدة عقود لعزل الحمض النووي الريبي سليمة المرتبطة إما الوحدات الفرعية risomeal أو أحادية، دي، وبولي ريبوسوم المجمعات3. لفترة وجيزة، يتم تطبيق الخلايا التي تم جمعها على تدرج السكروز الخطي والطرد المركزي وسرعة عالية، مما أدى إلى فصل الوحدات الفرعية الريبوسوم، الريبوسوم سليمة، والبوليسومات حسب الحجم. تقليديا، وقد تم تطبيق هذه التقنية لدراسة واحد أو عدد قليل من mRNAs، ولكن في الآونة الأخيرة تم الجمع بين هذه الطريقة مع دراسات RNA-seq لتوضيح وظيفة المنظمين الانتقالية المحتملة8،9 في حين أن وسيلة قوية للتمييز بين ترجمة بنشاط وعدم ترجمة mRNAs10،التنميط متعددة الجوانب لا تتطلب أساليب تستغرق وقتا طويلا (التدرج الكسور والطرد المركزي) ويمكن أن تتطلب قدرا كبيرا من عينة صنع تحليل خلية نادرة السكان تحديا.
وهناك نهج بديل لفحص الترجمة هو التنميط الريبوسمي ، الذي يحدد أجزاء من النصوص المرتبطة مباشرة مع الريبوسم. باختصار ، يتم إنشاء شظايا الحمض النووي الريبي المرتبطة بها عبر تحليل حماية RNase ، ومجمعات الريبوسوم الفردية المنفصلة عن طريق تدرج السكروز ، وشظايا الحمض النووي الريبي المرتبطة بها المعزولة وتحويلها إلى علامات RNA-seq قابلة للتسلسل العميق11. واحدة من الفوائد الرئيسية لتنميط الريبوسوم هو القدرة على تحديد مواقع محددة من الريبوسوم في وقت العزلة التي تسمح بتحديد مواقع بدء الترجمة، وحساب شغل الريالصدر والتوزيع، وتحديد أكشاك الريبوسوم12. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها العديد من العيوب المتأصلة ، بما في ذلك احتياجات المعدات (الكسر التدرجي وultracentrifuge) ، وهو بروتوكول معقد نسبيًا يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها على نطاق واسع ، والمشكلات الحسابية التي لا يمكن التعامل معها بسهولة من قبل المستخدم11عديم الخبرة . الأهم من ذلك ، يتم تطبيق التنميط الريبوسوم في المقام الأول على الخلايا المعزولة في الثقافة ويتطلب مواد كبيرة ، مما يجعل تطبيقه على الأنسجة المختلطة من نوع الخلايا أو الخلايا المصنفة من في الجسم الحي محدودة.
طريقة ريبوتاغ الثدييات، التي وضعتها سانز وآخرون في عام 200913،يلغي عددا من القضايا الكامنة في كل من التنميط المتعدد والريبوسوم. في هذه الطريقة ، يمكن عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوم عن أنواع الخلايا المحددة مما يسمح بالتحقيق في الترجمة المحددة من نوع الخلية في الأنسجة المعقدة دون تقنيات عزل إضافية ومعدات متخصصة ، كما هو ضروري في طرق أخرى13،14. أساس طريقة RiboTag هو نموذج الماوس المعدلة وراثيا (RiboTag) تحمل مكان تعديل ل60S ribosomal subunit بروتين الجينات Rpl22. يتضمن هذا الموضع(Rpl22-HA)إكسون محطة متخبط ة متبوعة بنسخة إضافية من exon المحطة الطرفية المعدلة لتشمل علامة Hemagglutinin C-terminal (HA) داخل منطقة الترميز. عندما عبرت إلى ماوس يعبر عن الـ Cre Recombinase خاصة بالخلية، تتم إزالة exon floxed السماح بالتعبير عن RPL22 الموسومة HA بطريقة محددة الخلية(الشكل 1). ويمكن بعد ذلك استخدام علامة HA للترسبات الريبوسوم المناعية (IP) والحمض النووي الريبي المرتبط بها من نوع الخلية المحدد.
وبالإضافة إلى النشر الأولي الذي طور هذه التقنية، استخدمت عدة مختبرات أخرى نموذج ريبوتاغ. الأنسجة المتنوعة مثل الماوس سيرتولي وخلايا ليديغ15، microglia16، الخلايا العصبية17،18، البويضات19، والخلايا المستزرعة20 وقد تم لمحة ودراستها. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو واضح قادرة على عزل بنجاح الريبوسوم والرناس المرتبطة بها عبر أنواع الأنسجة المتنوعة لا تزال هناك مناطق تحتاج إلى تحسين، وخاصة عندما تطبق على أنظمة متحولة. على وجه الخصوص ، يؤدي الاعتماد المشترك على الأنسجة الطازجة إلى زيادة الاختلاف التقني الذي يمكن أن يقلل إلى حد كبير من قوة التحليل. ثانياً، يتم جعل التحديد الواثق للأهداف المترجمة بشكل تفاضلي أكثر صعوبة عندما تحدث خلفية عالية من التهطال المناعي من أنواع الخلايا غير المؤتلفة كما تم الإبلاغ عنها سابقًافي 13. في حين أن سانز وآخرين هندسوا الفرضية الأساسية للتقنية ، في هذه المخطوطة يقدم مختبر سنايدر التحسين من البروتوكول للحد من هذه المخاوف ، مما يجعل الأسلوب أكثر عملية وكفاءة.
الغرض من هذه المقالة هو شرح الخطوات لتربية الفئران التي تعبر عن الريبوسوم المحددة بالخلايا ، وترسيب هذه الريبوسوم من العينات المجمدة فلاش ، وتنقية الحمض النووي المرتبطة بها لمزيد من التحليلات المصب. وبما أن الخلية الجرثومية الذكورية للثدييات وطفرة العقم المدروسة توفران تحديات فريدة من نوعها، فقد بُذلت جهود لإلقاء الضوء على الطرق التي يمكن بها تكييف هذه التقنية مع أنظمة الخلايا الأخرى.
فهم الترجمة من نوع خلية معينة لا تقدر بثمن لفهم علم وظائف الأعضاء في الخلية بشكل أكثر دقة في الحالة العادية أو المتحولة. وينظر إلى فائدة خاصة في النظم حيث يتم فصل الترجمة من النسخ، كما هو الحال في الأنسجة العصبية حيث تحدث الترجمة بعيدا جدا عن النسخ، أو في الخلايا الجرثومية حيث يحدث النسخ قبل وقت طويل من الترجمة. نسبة إلى أساليب أخرى لتحليل الترجمة ، فإن أكبر ميزة لنظام RiboTag تأتي من استخدام نظام Rere recombinase. وهذا يسمح بحرية استهداف أي مجموعة خلايا لديها برنامج تشغيل Cre ذات الصلة. ثانياً، إن IP RiboTag كما هو موضح هنا فعال وأقل تحدياً من الناحية التقنية ويستغرق وقتاً طويلاً من التنميط المتعدد أو الريبوسوم. وأخيرا، يمكن أن ينفذ ريبوتاغ IP بسهولة في مقاعد البدلاء.
هناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. ومن أهمها إنشاء خط الماوس ريبوتاغ وتوليد الحيوانات التجريبية للدراسة. أما بالنسبة لجميع النماذج الوراثية ، ينبغي تطبيق تتبع دقيق للأفراد داخل مستعمرة الماوس وكذلك بروتوكولات الجينية الدقيقة. يجب أن يتضمن PCR genotyping حسب Sanz et al. المبادئ التمهيدية التي تستهدف موقع loxP 5 ‘ من exon 4 من النمط البري للتمييز بين alleles النمط البري (260 bp) ومتحولة (290 bp)13. بالنسبة لحالة تحليل RiboTag في نماذج الخلايا الجرثومية ، يجب الالتزام بمتطلبات تربية محددة للغاية. أولاً، في حالة المسوخ التي تؤدي إلى العقم، ينبغي أن تتضمن استراتيجيات التربية المدروسة أساليب لتحسين عدد النسل الذي يحتوي على النمط الجيني المطلوب في الأجيال المتوسطة والتجريبية. ثانيا ، في حالة الخلاياالجرثومية محددة كريس ، ينبغي توخي الحذر بشأن الكري– zygosity نظرا لحساسية الخلايا الجرثومية لسمية الكري. في الخلية الجرثومية ، يمكن أن يكون لمستويات عالية من بروتين الكري آثار ضارة22، تحظر استخدام الحيوانات Cre / Cre في مخطط التربية. وأخيرا، عند استخدام الخلية الجرثومية Cres، من المهم عزل أليل RiboTag من الكري حتى الجيل الأخير كتعبير كري في الخلية الجرثومية من جيل وسيطة سيؤدي إلى ذرية التعبير Rpl22-HA على الصعيد العالمي.
بغض النظر عن نظام الخلية، يمكن التحقق من متانة كل من التعبير والتحديد. يمكن تحديد التعبير السليم لـ Cre وختان Rpl22-HA المتوقع باستخدام طرق متعددة. في الأول ، يمكن تلطيخ الأنسجة المعزولة عن الحيوانات التجريبية لHA باستخدام إما الكيمياء المناعية أو الفلورة المناعية15. هذه الطريقة هي الأمثل من حيث أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من mRNAs المترجمة في أنواع الخلايا المستهدفة. الطريقة الثانية ، مثال على ذلك هو موضح في الشكل 6، يتطلب بعض المعرفة من الرسائل المنظمة ترجمة في أنواع الخلايا المستهدفة. في هذه الطريقة، يمكن تأكيد الإثراء لمرنا الخاضعة للترجمة المعروفة من برنامج تشغيل Cre-driverالمحدد باستخدام PCR الكمي من IPed مقابل RNA المدخل. وبالمثل، يمكن تأكيد التعبير Rpl22-HA قوية من خلال مقارنة عينات Cre +/Rpl22+ (الضوابط الإيجابية) مع إما Cre-/Rpl22+ أو Cre+/Rpl22-العينات التي تعمل كعناصر تحكم سلبية فعالة (انظر الشكل 3). ويمكن لهذه المقارنات إما القيام بها على مجموع الحمض النووي الريبي IPed أو التخصيب لمرنا منظمة ترجمة معروفة تقييمها من قبل qRT-PCR أو بعض الأسلوب الكمي الأخرى.
المشاكل الشائعة في تنفيذ البروتوكول تميل إلى أن تصبح واضحة فقط عندما يكون العائد الحمض النووي الريبي منخفضة بشكل غير متوقع أو عالية. السبب الأكثر شيوعا لهذه الإخفاقات تنشأ من الجينوية غير صحيحة من الأفراد. نوصي بالاحتفاظ بأنسجة إضافية من العينات التي تم جمعها لتأكيد الأنماط الجينية لجميع العينات في حالة غلة الحمض النووي الريبي غير المتوقعة. وبمجرد التأكد من ذلك، ينبغي النظر في إمكانيات أخرى تشمل إمكانية تلوث RNase أو تحلل العينات. يمكن تخزين العينة بعناية والتعامل مع وصيانة المناطق الحرة RNase داخل المختبر إلى حد كبير أو القضاء على هذه القضايا. على الرغم من أن قضايا العزل الجيش الملكي النيبالي هي مشكلة أخرى محتملة في هذا البروتوكول، فإن استخدام مجموعات التجارية يقلل كثيرا من هذه المسألة على الرغم من أنه ينبغي الحرص على ضمان الحفاظ عليها كما RNase الحرة وتحتوي على أي حلول منتهية الصلاحية. وأخيراً، وكما هو الحال مع جميع الإجراءات القائمة على الأجسام المضادة، فإن الاختلافات في الكثير، وظروف التخزين، والتركيز، أو حتى الشحن لها القدرة على التأثير سلباً على جودة الجسم المضاد والنجاح اللاحق للسحب. ونتيجة لذلك، وبعد إجراء اختبارات دقيقة ومتكررة، اخترنا الأجسام المضادة الأكثر اتساقًا وكفاءة المتاحة.
يحتوي هذا البروتوكول على تعديلين رئيسيين بالنسبة لبروتوكولات RiboTag المنشورة الأخرى التي تعزز بشكل كبير احتمال النجاح. واحد هو القدرة على استخدام الأنسجة المجمدة فلاش، وبالتالي التخفيف من أي قضايا تنطوي على الكثير، فني، أو الاختلافات تشغيل التقنية. يمكن جمع العينات وتخزينها مما يسمح بعزل HA-ribosomes من جميع العينات في وقت واحد ، مما يقلل مما قد يكون مصادر رئيسية للاختلاف. ثانياً، إن إضافة الخطوة الواضحة مسبقاً تقلل إلى حد كبير من نوع الخلفية التي أبلغ عنها المستخدمون الآخرون لنظام ريبوتاغ. في الآونة الأخيرة ، يشير تقرير بروتوكول من قبل سانز وآخرون إلى وجود خلفية عالية بسبب وفرة النصوص المرتبطة بالريبوسوسوم من الخلايا غير الموجهة إلىCre14. لدينا بروتوكول العلاجات هذه المسألة عن طريق تضمين خطوة preclearing ، والقضاء على نحو فعال وجود الجيش الملكي النيبالي في عينات الملكية الفكرية السلبية Cre.
ومثل جميع النظم، ينبغي أن توضع في الاعتبار القيود المتأصلة في نظام ريبوتاغ. عند استخدام برامج تشغيل الـ Cre غير المحددة، يجب إجراء تحليل التعبير قبل إنتاج العينات التجريبية. ومن منظور الترجمة، ينبغي ملاحظة عدة فروق دقيقة في هذه الطريقة. أولاً، لا يسمح RiboTag بالتفريق بين mRNAs التي تستعد للترجمة وتلك التي تترجم بنشاط. وعلى هذا النحو، فإن الأساليب الحالية القائمة على الريبوتاغ لا تسمح بتقدير كفاءة الترجمة كدالة لفرادى المواد المتعددة الرنانة والمواد الرنانة. إذا كانت كفاءة الترجمة ذات أهمية، يمكن قياسها على أساس خاص بالخلية إذا تم دمج طريقة RiboTag مع أدوات تحليل الترجمة الأخرى مثل التنميط المتعدد. ثانياً، من الأساسي أن تؤخذ في الاعتبار إجمالي التغيرات في وفرة الحمض النووي الريبي الناجمة عن التباين الفردي أو الجيني المعتمد. ولهذا السبب فإن العزلالدقيق للحمض النووي الريبي المصاحب للحمض النووي الريبي المدخلات وتبقى العينات المستمدة من كل منها مقترنة في جميع التحليلات النهائية. وأخيراً، وفيما يتعلق بالتحليل القائم على الريبوتاغ، ينبغي أن نتذكر أن الارتباط بالريبوسوم لا يثبت بالضرورة أن الترجمة تحدث. وينبغي إجراء أساليب ثانوية للتحليل لتأكيد التنظيم الترجمي في الأهداف ذات الاهتمام.
يصف هذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالريبوسوسوم من الخلايا الجرثومية للفئران الذكور باستخدام نموذج RiboTag. لا المحاسبة لتربية الفئران وجمع العينات ، والبروتوكول يستغرق يومين ، مع ثلاث ساعات في اليوم الأول ، وأفضل القيام به في فترة ما بعد الظهر ، وحضانة بين عشية وضحاها ، تليها خمس ساعات من العمل في الصباح التالي. ويوصى بشدة أن إعداد حلول الأسهم (HB وHSWB) وكذلك طحن الأنسجة أن يتم مقدما. يعتمد النجاح العام للبروتوكول على الطباعة الجينية الصحيحة والظروف الخالية من RNase بشكل صارم. وتسمح القدرة على فحص الترجمة لأنواع معينة من الخلايا الدراسات المستقبلية لفهم أفضل للعلاقة بين النسخ والترجمة والبروتيوم في أنواع الخلايا لا تعد ولا تحصى والخلفيات المتحولة.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة NICHD R00HD083521 إلى EMS والدعم الداخلي من جامعة روتجرز إلى EMS.
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |