Här beskriver vi immunnederbörd av ribosomer och tillhörande RNA från utvalda populationer av vuxna manliga musbakterier celler med hjälp av RiboTag-systemet. Strategisk avel och noggrann immunnederbörd resulterar i rena, reproducerbara resultat som informerar om könscellsöversättning en inblick i mekanismerna för muterade fenotyper.
Kvantifiera skillnader i mRNA överflöd är ett klassiskt tillvägagångssätt för att förstå effekterna av en viss genmutation på cellfysiologi. Teckenskillnader i översättaren (hela översatta mRNAs) ger dock ytterligare ett lager av information som är särskilt användbar när man försöker förstå funktionen av RNA-reglering eller bindande proteiner. Ett antal metoder för att åstadkomma detta har utvecklats, inklusive ribosome profilering och polysome analys. Båda metoderna har dock betydande tekniska utmaningar och kan inte tillämpas på specifika cellpopulationer i en vävnad om de inte kombineras med ytterligare sorteringsmetoder. RiboTag-metoden är däremot ett genetiskt baserat, effektivt och tekniskt enkelt alternativ som gör det möjligt att identifiera ribosomassocierade RNA-kort från specifika cellpopulationer utan att lägga till sorteringssteg, förutsatt att en tillämplig cellspecifik Cre-drivrutin finns tillgänglig. Denna metod består av avel för att generera genetiska modeller, provinsamling, immunnederbörd och nedströms RNA-analyser. Här beskriver vi denna process i vuxna manliga musbakterier celler mutant för en RNA bindande protein som krävs för manlig fertilitet. Särskild uppmärksamhet ägnas åt överväganden för avel med fokus på effektiv koloniförvaltning och generering av korrekt genetisk bakgrund och immunnederbörd för att minska bakgrunden och optimera produktionen. Diskussion om felsökningsalternativ, ytterligare bekräftande experiment och potentiella nedströmsprogram ingår också. De presenterade genetiska verktygen och molekylära protokoll utgör ett kraftfullt sätt att beskriva de ribosomassocierade RNAs av specifika cellpopulationer i komplexa vävnader eller i system med avvikande mRNA-lagring och översättning med målet att informera om de molekylära drivkrafterna för mutantfenotyper.
Analys av en cell eller vävnads RNA överflöd, som undersöks av microarray eller RNA-sekvensering, har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära drivkrafterna för mutantfenotyper. Dessa relativt ofullständiga analysverktyg får dock inte informera om cellens fysiologi eller proteom, särskilt i system där många mRNAs lagras före översättning såsom neurala och könsceller. I dessa system, definiera befolkningen i mRNAs aktivt översätts till protein, eller cellens translatome, kan vara en bättre indikator på cellens faktiska fysiologiska tillstånd1,2. Till exempel könsceller i olika utvecklingsstadier transkribera RNAs som lagras för senare översättning, drivs antingen av utvecklingsmässiga3 eller signalering ledtrådar4. Denna process exemplifieras av mRNAs kodning protaminer, där mRNA avskrift är detekterbara dagar innan proteinet görs1,2,5,6. På samma sätt transkriberar neurala celler RNA i kärnan och transportera ner yxan, vilket är fallet med β-actin7. Förutom dessa specialiserade cellsystem, steady-state transkriptomer är osannolikt att vara informativ i modeller där RNA lagring, ribosome biogenesis, eller mRNA översättning påverkas. Flera andra faktorer kan också påverka en cells steady-state RNA pool inkluderar mRNA förfall och aktiviteten av RNA bindande proteiner. I dessa fall är robusta verktyg för att analysera ribosomassocierade RNAs eller mRNAs under aktiv översättning mer benägna att ge biologiskt relevanta resultat.
I detta syfte har flera metoder utvecklats för att identifiera ribosomassocierade eller aktivt översatta meddelanden. Polysome profilering, som ger en ögonblicksbild av ribosom associerade utskrifter, har använts i många decennier för att isolera intakta RNAs i samband med antingen ribosomal underenheter eller mono-, di-, och poly-ribosom komplex3. Kortfattat appliceras insamlade celllysningar på en linjär sackarosgradient och centrifugeras som hög hastighet, vilket resulterar i separation av ribosomerna, intakta ribosomer och polysomer efter storlek. Traditionellt har denna teknik tillämpats för att studera en eller några mRNAs, men nyligen har denna metod kombinerats med RNA-seq studier för att belysa funktionen hos potentiella translationella regulatorer8,9 Medan ett kraftfullt sätt att skilja mellan aktivt översätta och icke-översätta mRNAs10,polysome profilering kräver tidskrävande metoder (gradient fraktionering och ultracentrifug) och kan kräva en hel del prov gör analysen av sällsynta cell populationer utmanande.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att undersöka översättan är ribosome profilering, som identifierar de delar av utskrifter som är direkt förknippade med ribosomen. I korthet genereras ribosomassocierade RNA-fragment via RNase skyddsanalys, enskilda ribosomkomplex åtskilda via sackarosgradient och tillhörande RNA-fragment isolerade och konverterade till RNA-seq-taggar som är mottagliga för djupsekvensering11. En av de viktigaste fördelarna för ribosome profilering är förmågan att bestämma de specifika platserna för ribosomerna vid tidpunkten för isolering som gör det möjligt att identifiera översättningstart platser, beräkning av ribosomal beläggning och distribution, och identifiering av ribosom bås12. Denna metod har dock flera inneboende nackdelar, inklusive utrustningsbehov (gradientfraktioneratorn och ultracentrifug), ett relativt komplext protokoll som kräver omfattande felsökning och beräkningsproblem som inte lätt hanteras av den oerfarna användaren11. Viktigt, ribosome profilering tillämpas främst på isolerade celler i kulturen och kräver betydande material, vilket gör dess tillämpning på blandade cell-typ vävnader eller sorterade celler från in vivo begränsad.
Den däggdjurribotag metod, som utvecklats av Sanz et al. under 200913, eliminerar ett antal frågor som är inneboende i både polysomoch ribosome profilering. I denna metod kan ribosome-associerade RNAs isoleras från specifika celltyper som möjliggör undersökning av celltyp specifika översättar i komplexa vävnader utan ytterligare isoleringtekniker och specialiserad utrustning, vilket är nödvändigt i andra metoder13,14. Grunden för RiboTag-metoden är en transgen musmodell (RiboTag) som bär en modifierad locus för 60S ribosomal subunit protein gen Rpl22. Denna locus (Rpl22-HA) innehåller en floxed terminal exon följt av en ytterligare kopia av terminalexon ändras för att inkludera en C-terminal hemagglutinin (HA) tag inom kodning regionen. När den korsas till en mus som uttrycker en cellspecifik Cre Recombinase tas den floxed exon bort så att uttrycket av HA-märkta RPL22 på ett cellspecifikt sätt(figur 1). HA-taggen kan sedan användas för att immunoprecipitate (IP) ribosomer och deras tillhörande RNAs från den valda celltypen.
Förutom den första publikationen som utvecklade tekniken har flera andra laboratorier använt RiboTag-modellen. Olika vävnader som mus Sertoli och Leydig celler15, microglia16, nervceller17,18, äggceller19, och odlade celler20 har profilerats och studerats. Även om detta protokoll är klart kunna framgångsrikt isolera ribosomer och tillhörande RNAs över en mångsidig vävnad typer finns det fortfarande områden som behöver förbättras, särskilt när de tillämpas på mutantsystem. I synnerhet leder vanligt beroende av färsk vävnad till ökad teknisk variation som i hög grad kan minska analysens kraft. För det andra, säker identifiering av differentierade översatta mål görs mer utmanande när hög immunnederbörd bakgrund uppstår frånicke-Cre recombined celltyper som tidigare rapporterats13. Medan Sanz et al. konstruerade den grundläggande förutsättningen för tekniken, presenterar Snyder-laboratoriet i detta manuskript optimering av protokollet för att minska dessa problem, vilket gör metoden mer praktisk och effektiv.
Syftet med denna artikel är att förklara stegen för avel möss uttrycker cell-specifika HA-märkta ribosomer, immunoprecipitating dessa ribosomer från flash-frysta prover, och rena sina tillhörande RNAs för ytterligare nedströms analyser. Eftersom däggdjurscellen i hanen och infertilitetsmutationen som studeras ger unika utmaningar har ansträngningar gjorts för att belysa hur denna teknik kan anpassas till andra cellsystem.
Att förstå översättan det normala eller muterade tillståndet. Särskild nytta ses i system där översättning är frikopplad från transkription, såsom i neuralvävnad där översättning sker mycket långt från transkription, eller i könsceller där transkription sker långt före översättning. I förhållande till andra metoder för translatome analys, RiboTag systemets största fördel kommer från användningen av Cre recombinase systemet. Detta gör det möjligt för friheten att rikta sig till alla cellpopulationer som har en relevant Cre-förare. För det andra är RiboTag IP som beskrivs häri effektiv och mycket mindre tekniskt utmanande och tidskrävande än antingen polysomen eller ribosome profilering. Slutligen kan RiboTag IP enkelt utföras på bänkskivan.
Det finns ett antal kritiska steg i det här protokollet. Främst bland dem är inrättandet av RiboTag muslinje och generering av försöksdjur för studier. När det gäller alla genetiska modeller, noggrann spårning av individer inom muskolonin samt noggrann genotypning protokoll bör tillämpas. PCR genotyping enligt Sanz et al. bör omfatta primers inriktning loxP plats 5 “av wildtype exon 4 att skilja mellan wildtype alleler (260 bp) och mutant (290 bp)13. När det gäller RiboTag-analys i könscellsmodeller bör mycket specifika avelskrav följas. För det första, när det gäller mutanter som resulterar i infertilitet, tankeväckande avel strategier bör innehålla metoder för att optimera antalet avkommor med önskad genotyp i mellanliggande och experimentella generationer. För det andra, när det gäller könsceller specifika Cres,bör försiktighet iakttas om Cre-zygosity med tanke på känsligheten hos könsceller till Cre toxicitet. I könsceller cell, höga halter av Cre protein kan ha skadliga effekter22, förbjuder användning av Cre / Cre djur i avelsystemet. Slutligen, när du använder könsceller Cres, är det viktigt att isolera RiboTag allele från Cre tillden sista generationen som Cre uttryck i könsceller cellen i en mellanliggande generation kommer att resultera i avkommor uttrycker Rpl22-HA globalt.
Oavsett cellsystem är ett antal rekommenderade kontroller möjliga för att verifiera robustheten i både Cre-uttryck och specificitet. Korrekt uttryck för din Cre och förväntad excision av Rpl22-HA kan bestämmas med hjälp av flera metoder. I den första, vävnad isolerade från försöksdjur kan färgas för HA med antingen immunohistochemistry eller immunofluorescens15. Denna metod är optimal eftersom det inte kräver någon priori kunskap om översatta mRNAs i målcelltyper. Den andra metoden, vars exempel visas i figur 6,kräver viss kunskap om översättningsreglerade meddelanden i målcelltyperna. I denna metod kan anrikning för en känd translationellt reglerad mRNA bekräftas från den valda Cre-drivrutinen med kvantitativ PCR av IPed kontra indata RNA. På samma sätt kan robusta Rpl22-HA-uttryck bekräftas i jämförelse med prover na cre+/Rpl22+(positiva kontroller) med antingen Cre-/Rpl22+ eller Cre+/Rpl22- prover som fungerar som effektiva negativa kontroller (se figur 3). Dessa jämförelser kan antingen göras på den totala IPed RNA eller anrikning för en känd translationellt reglerad mRNA bedöms med qRT-PCR eller någon annan kvantitativ metod.
Vanliga problem i genomförandet av protokollet tenderar att bara bli uppenbara när RNA-avkastningen är oväntat låg eller hög. Den vanligaste orsaken till dessa fel uppstår på grund av felaktig genotypning av individer. Vi rekommenderar att du behåller ytterligare vävnad från insamlat prov för att bekräfta genotyper av alla prover vid oväntade RNA-avkastning. När det har bekräftats bör andra möjligheter övervägas, inklusive möjligheten till rnaskontaminering eller provnedbrytning. Noggrann provlagring och hantering och underhåll av RNase frizoner inom laboratoriet kan kraftigt minska eller eliminera dessa frågor. Även om RNA isolering frågor är ett annat potentiellt problem i detta protokoll, minskar användningen av kommersiella kit kraftigt denna fråga men försiktighet bör iakttas för att säkerställa att de underhålls som RNase gratis och innehåller inga utgångna lösningar. Slutligen, som med alla antikroppsbaserade förfaranden, variationer i parti, lagringsförhållanden, koncentration, eller till och med sjöfarten har potential att negativt påverka antikroppens kvalitet och den efterföljande framgången för neddragningen. Som ett resultat, efter noggranna och upprepade tester, valde vi den mest konsekventa och effektiva antikropp tillgängliga.
Detta protokoll innehåller två större ändringar i förhållande till andra publicerade RiboTag-protokoll som avsevärt ökar sannolikheten för framgång. En är förmågan att använda flash fryst vävnad, vilket mildrar eventuella problem som rör parti, tekniker eller tekniska kör variationer. Prover kan samlas in och lagras så att isolering av HA-ribosomer från alla prover på en gång, sänka vad som kan vara stora källor till variation. För det andra minskar tillägget av det preclear-steget avsevärt den typ av bakgrund som rapporterats av andra användare av RiboTag-systemet. Nyligen, ett protokoll rapport från Sanz et al. visar förekomsten av hög bakgrund på grund av överflöd av ribosom-associerade utskrifter frånicke-Cre-drivnaceller14. Vårt protokoll löser detta problem genom att inkludera ett preclearingsteg, vilket effektivt eliminerar förekomsten av RNA i Cre negativa IP-prover.
Liksom alla system, bör de inneboende begränsningarna i RiboTag-systemet hållas i åtanke. Vid användning av okarakteriserade Cre-drivrutiner bör analys av uttryck utföras före experimentell provproduktion. Ur översättningsperspektiv bör flera nyanser av denna metod noteras. För det första tillåter RiboTag inte differentiering mellan mRNAs redo att översätta och de som aktivt översätter. Därför tillåter nuvarande RiboTag-baserade metoder inte kvantifieringen av översättningseffektiviteten som en funktion av enskilda mRNAs. Om översättningseffektiviteten är av intresse kan den mätas på cellspecifik basis om RiboTag-metoden kombineras med andra översättningsanalysverktyg som polydurig profilering. För det andra är det grundläggande att ta hänsyn till de totala RNA-överflödsförändringar som härrör från enskilda eller genotypberoende varians. Det är av denna anledning som noggrann isolering av ingång RNA åtföljer immunnederbörd och prover som härrör från varje förblir ihopkopplade under alla nedströmsanalyser. Slutligen, och när det gäller RiboTag-baserad analys, bör man komma ihåg att associering med en ribosom inte nödvändigtvis bevisa översättning sker. Sekundära analysmetoder bör utföras för att bekräfta translationell reglering i intressemål.
Detta protokoll beskriver isoleringen av ribosomassocierade RNAs från könsceller hos hanmöss med riboTag-modellen. Inte står för musavel och provinsamling, tar protokollet två dagar, med tre timmar den första dagen, bäst gjort på eftermiddagen, en övernattning inkubation, följt av fem timmars arbete den efterföljande morgonen. Det rekommenderas starkt att beredning av lagerlösningar (HB och HSWB) samt vävnadsslipning görs i förväg. Den övergripande framgången för protokollet är beroende av korrekt genotypning och strikt RNase-fria förhållanden. Möjligheten att undersöka översättningen av specifika celltyper gör det möjligt för framtida studier att bättre förstå förhållandet mellan transkription, översättning och proteom i otaliga celltyper och mutanta bakgrunder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av NIH bevilja NICHD R00HD083521 till EMS och internt stöd från Rutgers University till EMS.
1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
Dissection scissors | Preference of researcher | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
Heat block | Preference of researcher | ||
Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |