פגיעה מוחית כתוצאה בלייזר בקליפת המוח המוטורית של חולדות
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מראה טכניקה ליצירת מודל מכרסם של פגיעה מוחית. השיטה המתוארת כאן משתמשת בהקרן לייזר ותועדת לקליפת המוח המוטורית.
Abstract
טכניקה נפוצה לגרמת שבץ במודלים של מכרסמים ניסיוניים כרוכה ארעי (מסומן לעתים קרובות MCAO-t) או קבוע (מוגדר MCAO-p) חסימה של העורק המוחי האמצעי (MCA) באמצעות צנתר. טכניקה מקובלת זו, עם זאת, יש כמה מגבלות, ובכך להגביל את השימוש הנרחב שלה. אינדוקציה שבץ בשיטה זו מאופיינת לעתים קרובות על ידי שונות גבוהה במיקום ובגודל של האזור האיסכמי, התרחשויות תקופתיות של דימום, שיעורי מוות גבוהים. כמו כן, השלמה מוצלחת של כל אחד מהנהלים ארעיים או קבועים דורשת מומחיות ולעתים קרובות נמשכה כ-30 דקות. בפרוטוקול זה, טכניקה להקרן לייזר מוצגת שיכול לשמש כשיטה חלופית לגירוי וללמוד פגיעה מוחית במודלים מכרסמים.
בהשוואה לחולדות בקבוצות הבקרה ו-MCAO, פגיעה מוחית על ידי אינדוקציה לייזר הראה השתנות מופחתת בטמפרטורת הגוף, נפח אוטם, בצקת במוח, דימום תוך גולגולתי, ותמותה. יתר על כן, השימוש בפציעה המושרה בלייזר גרם נזק לרקמות המוח רק בקליפת המוח המוטורית שלא כמו בניסויי MCAO שבו נצפתה הרס של קליפת המוח המוטורית ורקמות סטריאטל.
ממצאים מחקירה זו מצביעים על כך שהקרן לייזר יכולה לשמש טכניקה חלופית ויעילה לגירוי פגיעה מוחית בקליפת המוח המוטורית. השיטה גם מקצרת את הזמן להשלמת ההליך ואינה דורשת מטפלים מומחים.
Introduction
ברחבי העולם, שבץ מוחי הוא סיבת המוות המובילה השנייה והגורם השלישי המוביל לנכות1. שבץ מוחי מוביל גם לנכות חמורה, הדורשת לעתים קרובות טיפול נוסף מהצוות הרפואי וקרובי משפחה. יש, לכן, צורך להבין את הסיבוכים הקשורים להפרעה ולשפר את הפוטנציאל לתוצאות חיוביות יותר.
השימוש במודלים של בעלי חיים הוא הצעד הראשוני להבנת מחלות. כדי להבטיח את תוצאות המחקר הטובות ביותר, מודל טיפוסי יכלול טכניקה פשוטה, affordability, שכפול גבוה, ושונות מינימלית. הקובעים במודלים שבץ איסכמי כוללים נפח בצקת במוח, גודל אוטם, היקף מחסום הדם – מוח (BBB) התמוטטות, וליקוי תפקודי בדרך כלל מוערך באמצעות ציון חומרתנוירולוגית 2.
טכניקת אינדוקציה שבץ הנפוץ ביותר במודלים מכרסמים חסום את עורק המוח האמצעי (MCA) באופן ארעי אולצמיתות 3. טכניקה זו מייצרת מודל שבץ דומה לאלה בבני אדם: יש לו penumbra המקיפה את האזור ליטף, הוא מאוד לשחזור, ומווסת תדיר איסכמיה משך reperfusion4. אף על פי כן, שיטת MCAO יש כמה סיבוכים. הטכניקה נוטה דימום תוך גולגולתי ופציעה ברשתית ipsilateral עם תפקוד לקוי של קליפת המוח החזותית היפרתרמיה נפוצה כי לעתים קרובות להוביללתוצאות נוספות 5,,6,7. מגבלות אחרות כוללות וריאציות גבוהות בשבץ המושרה (הנובע מההרחבה הסבירה של איסכמיה לאזורים לא מכוונים, כמו אזור העורק הראשי החיצוני), חסימה לא מספקת של MCA, וperperfusion מוקדם. כמו כן, חולדות של זנים וגדלים שונים להפגין כרכים אוטםשונים 8. בנוסף לכל החסרונות שהוזכרו, מודל MCAO לא יכול לגרום לשבץ מבודד קטן באזורים במוח עמוק, כי זה מוגבל מבחינה טכנית מבחינת הדרישה של גודל כלי מינימלי לצנתור. זה הופך את הצורך במודל חלופי ליותר קריטי. שיטה אחרת, photothrombosis, מספק חלופה אפשרית הליכי MCAO אבל לא לשפר את היעילות9. טכניקה זו מתמקדת שבץ עם אור ומציעה כמה שיפורים על הדגמים הקודמים. עם זאת, photothrombosis דורש פתיחת גולגולת פולשנית הקשורה compications משני9.
לאור החסרונות המתוארים, הפרוטוקול המוצג כאן מספק טכניקת לייזר חלופית מסוגלת לגרום פגיעה מוחית מכרסמים. מנגנון הפעולה של טכניקת הלייזר מבוסס על ההשפעות הפוטותרמיות של הלייזר המחקפות ברקמות חיות, מה שמוביל לספיגת קרני אור על ידי רקמות הגוף והמרה שלהן לחום. היתרונות של שימוש טכניקת לייזר הם הבטיחות שלה וקלות מניפולציה. היכולת של לייזר לייצר חום כדי להפסיק את הדימום עושה את זה חשוב מאוד ברפואה, בעוד היכולת שלה להגביר את הקורות השונות בנקודת מפגש נתון מבטיח כי לייזרים להימנע להרוס רקמות בריאות שעומד בדרך של נקודת היעד10. קרן הלייזר המשמשת בפרוטוקול זה יכולה לעבור דרך מדיום נוזלי נמוך, כגון עצם, מבלי לפלוט את האנרגיה שלה ו/או לגרום להרס ים. ברגע שהוא מגיע למדיום נוזלי גבוה, כגון רקמות המוח, הוא משתמש באנרגיה שלו כדי להרוס את רקמות היעד. הטכניקה, לכן, יכולה לגרום פגיעה מוחית רק באזור המתאים של המוח.
הטכניקה שהוצגה כאן הראתה כמות עצומה של יכולת לווסת את רמות ההקרינה שלה, ויצרה את הווריאציות הנבחרות של פגיעה מוחית שנועדה מההתחלה. שלא כמו MCAO המקורי המשפיע הן קליפת המוח סטריאטום, טכניקת הלייזר הצליח לווסת את ההשפעה של פגיעה מוחית, גורם לפציעה רק על קליפת המוח המוטורית המיועדת. בכאן, פרוטוקול פגיעה מוחית המושרה בלייזר וסיכום של תוצאות מייצגות עבור ההליך המבוצע על קליפת המוח של חולדות מסופקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה הוגן להניח כי טכניקת הלייזר היא פולשנית מינימלית, בהתחשב בכך שלא מקרי מוות או SAH התרחשו בקבוצת הלייזר. סיבת המוות העיקרית וSAH הוא הנזק לכלי הדם שמוביל לעלייה של לחץ תוך גולגולתי (ICP), כפי שמצג בטכניקות MCAOהמקוריות 10. היעדר מוות וSAH בקבוצת הלייזר הוא כנראה בשל ההשפעות הספציפיות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למחלקה להרדמה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת סורוקה וללל צוות המעבדה של אוניברסיטת בן-גוריון בנגב על עזרתם בביצוע ניסוי זה.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA – ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | SIGMA – ALDRICH | 76-03-9 | |
| Brain & Tissue Matrices | SIGMA – ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604E+11 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | SIGMA – ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | SIGMA – ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA – ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA – ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | SIGMA – ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf Tube | SIGMA – ALDRICH | EP0030119460 | |
| Ethanol 96 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| Evans Blue 2% | SIGMA – ALDRICH | 314-13-6 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | model Infinite 200 PRO multimode reader | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Infusion Cuff | ABN | IC-500 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| Multiset | TEVA MEDICAL | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | |
| Petri dishes | SIGMA – ALDRICH | P5606 | |
| Scalpel blades 11 | SIGMA – ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine | Laser Industries Ltd | ||
| Stereotaxic head holder | KOPF | 900LS | |
| Sterile Syringe 2 ml | Braun | 4606027V | |
| Syringe-needle 27 G | Braun | 305620 |
References
- World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
- Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
- Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
- Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
- Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
- Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
- Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
