À l’interface des solvants organiques et aqueux, les protéines amphiphiliques sur mesure de type élastine s’assemblent en structures supramoléculaires complexes telles que les vésicules, les fibres et les coacervates déclenchés par des paramètres environnementaux. Les protocoles d’assemblage décrits donnent des compartiments à base de membrane protéique (PMBCs) avec des propriétés de thon, permettant l’encapsulation de diverses cargaisons.
Les blocs de construction protéinés sur mesure sont des candidats polyvalents pour l’assemblage de structures supramoléculaires telles que des cellules minimales, des véhicules de livraison de médicaments et des échafaudages enzymatiques. En raison de leur biocompatibilité et de leur thonibilité sur le plan génétique, les protéines elastin (PEL) sont des éléments constitutifs idéaux pour les applications biotechnologiques et biomédicales. Néanmoins, l’assemblage de structures supramoléculaires basées sur des protéines avec des propriétés physiochimiques distinctes et un bon potentiel d’encapsulation demeure difficile.
Ici, nous fournissons deux protocoles efficaces pour l’auto-assemblage guidé des PEL amphiphiles dans des architectures de protéines supramoléculaires telles que les coacervates sphériques, les fibres et les vésicules stables. Les protocoles d’assemblage présentés génèrent des compartiments à base de membrane protéique (PMBC) basés sur les PEL ayant des propriétés physicochimiques adaptables. Les PMBC démontrent le comportement de séparation de phase et révèlent la fusion de membrane dépendante de la méthode et sont capables d’encapsuler des molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses. Les PMBC qui en résultent ont un potentiel d’application élevé en tant que plate-forme de formulation et d’administration de médicaments, de cellules artificielles et d’espace de réaction compartimenté.
L’assemblage de structures supramoléculaires pour les applications biotechnologiques devient de plus en plus important1,2,3,4,5. Pour l’assemblage d’architectures fonctionnelles telles que les coacervates, les vésicules et les fibres avec les propriétés physicochimiques souhaitées, il est important de comprendre et de contrôler les propriétés physicochimiques et conformationnelles des composants. En raison de la précision moléculaire des molécules présentes dans la nature, les blocs de construction des structures supramoléculaires sont de plus en plus basés sur les lipides, les acides nucléiques ou les protéines. Comparés aux polymères synthétiques, les blocs de construction protéinés permettent un contrôle précis sur les structures supramoléculairesémergentes 6 sur le plan génétique. La séquence primaire d’acide aminé (aa) des blocs de construction de protéines individuelles code intrinsèquement l’information pour leur potentiel d’assemblage du niveau moléculaire jusqu’au niveau macroscopique ainsi que la forme tridimensionnelle et les propriétés physiques de la structure supramoléculaire finale7.
Les méthodes signalées pour l’assemblage de différentes structures supramoléculaires impliquent souvent des protéines amphiphiles telles que des protéines sensibles à l’élastine sensible à la température (PEL)5,8,9, oléosine recombinante10et des amphiphiles protéinés artificiels11. Les méthodes déclenchées par la température ont conduit à l’assemblage de micelles4,10,12Fibres13Feuilles14et les vésicules9,15,16. Des méthodes impliquant des solvants organiques ont été appliquées pour la formation de vésicules dynamiques à base de protéines8,11,14. Jusqu’à présent, les protocoles appliqués pour la formation de vésicules manquent souvent de contrôle d’assemblage sur les assemblages de taille de micromètres16,17ou ont un rendement d’assemblage limité5. En outre, certains vésicules à base de PEL signalés ont un potentiel d’encapsulation altéré12ou une stabilité limitée au fil du temps9. En s’attaquant à ces inconvénients, les protocoles présentés permettent l’auto-assemblage de structures supramoléculaires de micromètre et de micromètres de taille avec des propriétés physiochimiques distinctes, un bon potentiel d’encapsulation et une stabilité de longue date. Les PEL amphiphiles sur mesure s’assemblent en structures supramoléculaires, allant des coacervates sphériques et des faisceaux de fibres torsadées très ordonnés aux vésicules nonilamellar selon le protocole appliqué et les conditions environnementales associées. Les grands compartiments à base de membrane protéique vésiculaire (PMBC) révèlent tous les phénotypes principaux tels que la fusion de membrane et le comportement de séparation de phase analogue aux liposomes. Les PMBC encapsulent efficacement les molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses qui peuvent être surveillées à l’aide d’une simple microscopie épifluorescence. Les domaines répétitifs du PEL utilisés dans cette étude sont des éléments constitutifs attrayants pour les architectures supramoléculaires à base de protéines18. L’unité de répétition de pentapeptide ELP (VPGVG) est connue pour tolérer différentes aa en plus de proline à la quatrième position (valine, V), tout en préservant ses propriétés structurelles et fonctionnelles19. La conception de PEL amphiphiles contenant des domaines hydrophiles et hydrophobes distinctifs a été réalisée en insérant des résidus d’invités aa (X) dans la répétition VPGXG avec hydrophobicité distincte, polarité, et charge20. Domaines amphiphiliques DE PEL où équipés de phénylalanine hydrophobe (F) ou d’isoleucine (I) tandis que le domaine hydrophile contenait de l’acide glutamique chargé (E) ou de l’arginine (R) comme résidus d’invités. Une liste des constructions de PEL amphiphiles admissibles et des séquences aa correspondantes se trouve dans les informations et références supplémentaires8,21. Tous les blocs de construction lorsqu’ils sont équipés de petites colorants fluorescentes ou de protéines fluorescentes pour la visualisation par microscopie à fluorescence. MEGFP et d’autres protéines fluorescentes ont été fusionnées en A-terminalement dans les domaines hydrophiles des amphiphiles du PEL. Les colorants organiques ont été conjugués par l’intermédiaire d’une souche sans cuivre promue cycloaddition alkyne-azide (SPAAC) à un acide aminé non naturel co-translationnellement introduit (UAA). L’incorporation co-translationnelle de l’UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22permet la modification N-terminale du domaine hydrophile PEL. De cette façon, le colorant fluorescent vert BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou toute petite molécule fluorescente avec un cyclooctyne tendu peut être utilisé comme sonde fluorescente. L’incorporation réussie de l’UAA pAzF et la cycloaddition du colorant via SPAAC peut être facilement confirmée par l’intermédiaire de LC-MS/MS en raison de l’ionisation efficace des peptides tryptiques correspondants8. Ce petit colorant organique a été appliqué pour élargir le choix de solvant pour les protocoles d’assemblage, puisque les protéines fluorescentes sont incompatibles avec la plupart des solvants organiques. Les deux protocoles d’assemblage les plus efficaces pour les structures supramoléculaires développées dans notre laboratoire sont décrits ci-dessous. La méthode de gonflement THF est seulement compatible avec le PEL amphiphilique modifié de colorant organique. En revanche, la méthode d’extrusion de 1 butanol (BuOH) est compatible avec de nombreuses protéines comme sonde fluorescente, par exemple mEGFP, puisque la méthode décrite préserve entièrement la fluorescence de ces protéines de fusion. En outre, l’encapsulation de petites molécules et le comportement de fusion vésiculaire fonctionne mieux en employant la méthode d’extrusion BuOH.
Un défaut tout en suivant les protocoles décrits pour l’assemblage de structures supramoléculaires définies conduit principalement à la formation d’agrégats non spécifiques(figure 2,IV) ou à distribués uniformément ELP-amphiphiles. Les étapes critiques du protocole sont discutées ci-dessous :
Pour un rendement à haute expression du PEL amphiphile, une température relativement basse de 20 oC est optimale. Pour la purification basée sur l’affini…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le BMBF pour son soutien financier et le Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) d’avoir fourni le centre de recherche. Nous sommes reconnaissants à P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californie, Etats-Unis pour fournir le plasmide pEVOL-pAzF. Nous remercions le personnel du Life Imaging Center (LIC) du Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) de l’Albert-Ludwigs-University Freiburg pour l’aider avec leurs ressources de microscopie confocale, et l’excellent soutien dans l’enregistrement d’images.
1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
2log DNA ladder | NEB | ||
2-Mercaptoethanol | Roth | ||
50 mL Falcon tubes | VWR | ||
79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
Acetic acid glacial | VWR | ||
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
Biofuge | Heraeus | ||
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
BspQI | NEB | ||
Camera DS Qi1 | Nikon | ||
Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
Chloramphenicol | Roth | ||
CompactStar CS 4 | VWR | ||
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
Digital sonifier | Branson | ||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
Dnase I | Applichem | ||
EarI | NEB | ||
EcoRI-HF | NEB | ||
Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
Ethanol absolute | Roth | ||
Ethidium bromide solution | Roth | ||
Filter supports | Avanti | ||
Glass plates | Bio-Rad | ||
Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
Glycin | Applichem | ||
H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
HindIII | NEB | ||
HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
Illuminator ix 20 | INTAS | ||
Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
Imidazole | Merck | ||
Immersions oil for microscopy | Merck | ||
Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
Inkubator 1000 | Heidolph | ||
IPTG, >99% | Roth | ||
Kanamycinsulfate | Roth | ||
L(+)-Arabinose | Roth | ||
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
LB-Medium | Roth | ||
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
Microscope CM 100 | Philips | ||
Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
Microscopy slides | VWR | ||
Microwave | Studio | ||
Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
PH meter 766 calimatic | Knick | ||
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
PowerPac basic | BioRad | ||
Propanol-2-ol | Emplura | ||
Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
Reinforcement rings | Herma | ||
SacI HF | NEB | ||
SDS Pellets | Roth | ||
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
T4 DNA Ligase | NEB | ||
TEMED | Roth | ||
TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
Thermomix comfort | Eppendorf | ||
THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
Triton X 100 | Roth | ||
Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Urea p.a. | Roth | ||
Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
XbaI | NEB | ||
XhoI | NEB | ||
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |