Summary

Направленная сборка эластиноподобных белков в определенные супрамолекулярные структуры и грузовую инкапсуляцию In Vitro

Published: April 08, 2020
doi:

Summary

На стыке органических и aqueous растворителей, с учетом амфифилических эластиноподобных белков, собираемых в сложные надмолекулярные структуры, такие как пузырьки, волокна и коацерваты, вызванные экологическими параметрами. Описанные протоколы сборки дают Белковые Мембраны на основе Сравнения (PMBCs) с настраиваемыми свойствами, что позволяет инкапсуляции различных грузов.

Abstract

Специализированные белковые строительные блоки являются универсальными кандидатами для сборки надмолекулярных структур, таких как минимальные клетки, средства доставки лекарств и ферментные леса. Благодаря своей биосовместимости и тюнике на генетическом уровне, эластиновые белки (ELP) являются идеальными строительными блоками для биотехнологического и биомедицинского применения. Тем не менее, сборка протеиновых надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами и хорошим инкапсуляционным потенциалом остается сложной задачей.

Здесь мы предоставляем два эффективных протокола для управляемой самосборки амфифилических ELPs в надмолекулярные белковые архитектуры, такие как сферические коакерваты, волокна и стабильные пузырьки. Представленные протоколы сборки генерируют белковые мембранные компоненты (PMBCs) на основе ELPs с адаптируемыми физикохимическими свойствами. PMBCs продемонстрировать фазовое поведение разделения и выявить метод зависимых мембранных синтеза и способны инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза. В результате PMBCs имеют высокий потенциал применения в качестве платформы разработки и доставки наркотиков, искусственных клеток, и разрозненные пространства реакции.

Introduction

Сборка надмолекулярных структур для биотехнологических применений становится все более важной1,,2,,3,,4,,5. Для сборки функциональных архитектур, таких как коацерваты, пузырьки и волокна с желаемыми физикохимическими свойствами, важно понимать и контролировать физико-химические и конформационные свойства компонентов. Благодаря молекулярной точности молекул, найденных в природе, строительные блоки для надмолекулярных структур все чаще основаны на липидах, нуклеиновых кислотах или белках. По сравнению с синтетическими полимерами, белковые строительные блоки позволяют точно контролировать возникающие надрамолекулярные структуры6 на генетическом уровне. Первичная аминокислота (аа) последовательность отдельных блоков здания протеина внутренне кодирует информацию для их потенциала агрегата от молекулярного до макроскопического уровня также, как трехмерная форма и физические свойства окончательной надмолекулярной структуры7.

Сообщаемые методы сборки различных надмолекулярных структур часто связаны с амфифильные белки, такие как чувствительные к температуре эластиновые белки (ELP)5,8,9, рекомбинантный олеозин10и искусственный белок амфифилов11. Методы срабатывания температуры привели к сборке мицеллей4,10,12Волокон13Листы14и везикулы9,15,16. Применяются методы, связанные с органическими растворителями, для формирования динамических белковых пузырьков8,11,14. До сих пор применяемые протоколы для формирования везикулчастой часто не имеют контроля сборки над сборками размером с микрометр16,17или имеют ограниченный урожай сборки5. Кроме того, некоторые сообщили ELP на основе пузырьков имеют нарушения инкапсуляции потенциал12или ограниченная стабильность с течением времени9. Устранение этих недостатков, представленные протоколы позволяют самосборку микрометра и субмикрометрового размера надмолекулярных структур с различными физиохимическими свойствами, хорошим потенциалом инкапсуляции и длительной стабильностью. Специализированные амфифилические ELPs собираются в надмолекулярные структуры, охватывающие диапазон от сферических коацерватов и высоко упорядоченных витой волокна пучки униламеллярных пузырьков в зависимости от прикладного протокола и связанных с ними условий окружающей среды. Большие везикулярные белковые мембранные сосульки (PMBC) выявляют все основные фенотипы, такие как мембранное слияние и поведение фазового разделения, аналогичное липосомам. PMBCs эффективно инкапсулировать химически разнообразные флуоресцентные молекулы груза, которые могут контролироваться с помощью простой эпифлюоресценции микроскопии. Повторяющиеся области ELP, используемые в данном исследовании, являются привлекательными строительными блоками для супрамолекулярных архитектур на основе белка18. ELP pentapeptide repeat unit (VPGVG), как известно, переносит различные аа, кроме пролина на четвертой позиции (valine, V), сохраняя при этом свои структурные и функциональные свойства19. Конструкция амфифильных ELPs, содержащая отличительные гидрофильные и гидрофобные домены, была реализована путем вставки остатков гостя aa (X) в повтор ЕС VPGXG с ярко выраженной гидрофобичностью, полярностью и зарядом20. Амфифильные области ELP, где оснащены гидрофобных фенилаланин (F) или изолейцин (I), в то время как гидрофильный домен содержал заряженную глутаминовую кислоту (E) или аргинин (R) в качестве остатков гостя. Список подходящих амфифилических конструкций ELP и соответствующих последовательностей aa можно найти в дополнительной информации и ссылках8,21. Все строительные блоки, где оснащены либо небольшими флуоресцентными красителями или флуоресцентными белками для визуализации с помощью флуоресценции микроскопии. mEGFP и другие флуоресцентные белки были N-терминально слиты с гидрофильных доменов амфифилов ELP. Органические красители были спряжены с помощью медь-свободного штамма способствовали алкин-азид цикловуда (SPAAC) в совместное переводно введены неестественные аминокислоты (UAA). Сотрансляционная инкорпорация UAApara-азидофенилаланин (pAzF)22позволяет N-терминал модификации гидрофильных домен ELP. Таким образом, зеленый флуоресцентный краситель BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) или любой небольшой флуоресцентной молекулы с напряженной циклоктин может быть использован в качестве флуоресцентного зонда. Успешное включение UAA pAzF и циклоaddition красителя через SPAAC может быть легко подтверждено с помощью LC-MS/MS благодаря эффективной ионизации соответствующих триптических пептидов8. Этот небольшой органический краситель был применен для расширения выбора растворителя для протоколов сборки, так как флуоресцентные белки несовместимы с большинством органических растворителей. Ниже описаны два наиболее эффективных протокола сборки надмолекулярных структур, разработанных в нашей лаборатории. Метод отеков THF совместим только с органическим красителем модифицированных амфифилических ELP. В отличие от этого, метод экструзии 1-бутанол (BuOH) совместим со многими белками, как флуоресцентный зонд, например, mEGFP, так как описанный метод полностью сохраняет флуоресценцию этих белков синтеза. Кроме того, инкапсуляция малых молекул и везикулярное поведение синтеза лучше всего работает, используя метод экструзии BuOH.

Protocol

1. Проектирование и клонирование амфифильных эластиноподобных белков (ELPs) Клон и дизайн конструкций, как описано в другом месте8,20. Плазмиды доступны по запросу. 2. Выражение белка, очищение и приготовление Выражение F20E20-mEGFP и F20…

Representative Results

Разработка протокола для производства везикулНа рисунке 1 описаны два различных метода подготовки везикля. Метод отеков THF на левой стороне состоит из трех последовательных шагов и приводит к различным надмолекулярным сборкам ELP в зависимост…

Discussion

Неисправность при следовании описанным протоколам для сборки определенных надмолекулярных структур в основном приводит либо к образованию неспецифических агрегатов(рисунок 2,IV), либо к однородно распределенным ЭЛП-амфифилам. Критические шаги протокола рассматривают…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят BMBF за финансовую поддержку и Центр биологического анализа систем (ЗБСА) за предоставление научно-исследовательского центра. Мы благодарны. Г. Шульцу, TSRI, La Jolla, California, США за предоставление плазмида pEVOL-pAzF. Мы благодарим сотрудников Центра визуализации жизни (LIC) в Центре биологического анализа систем (ЗБСА) Альберта-Людвига-Университета Фрайбурга за помощь в их конфокальной микроскопии ресурсов, а также отличную поддержку в записи изображений.

Materials

1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

References

  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

View Video