Summary

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

Published: April 08, 2020
doi:

Summary

Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Abstract

Blocos de construção protecários sob medida são candidatos versáteis para a montagem de estruturas supramoleculares, como células mínimas, veículos de entrega de drogas e andaimes enzimáticos. Devido à sua biocompatibilidade e sintonia no nível genético, as proteínas semelhantes à Elastina (ELP) são blocos de construção ideais para aplicações biotecnológicas e biomédicas. No entanto, a montagem de estruturas supramoleculares baseadas em proteínas com propriedades fisioquímicas distintas e bom potencial de encapsulamento permanece desafiadora.

Aqui fornecemos dois protocolos eficientes para a auto-montagem guiada de ELPs anfífilos em arquiteturas de proteínasupramolecular, tais como coacervates esféricos, fibras e vesículas estáveis. Os protocolos de montagem apresentados geram compartimentos à base de membrana siproteica (PMBCs) baseados em ELPs com propriedades físico-químicas adaptáveis. Os PMBCs demonstram o comportamento de separação de fase e revelam a fusão de membranadependente do método e são capazes de encapsular moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas. Os PMBCs resultantes têm um alto potencial de aplicação como uma plataforma de formulação e entrega de medicamentos, células artificiais e espaço de reação compartimentado.

Introduction

A montagem de estruturas supramoleculares para aplicações biotecnológicas está se tornando cada vez mais importante1,2,3,4,5. Para a montagem de arquiteturas funcionais como coacervates, vesículas e fibras com propriedades físico-químicas desejadas é importante entender e controlar as propriedades físico-químicas e conformacionais dos componentes. Devido à precisão molecular das moléculas encontradas na natureza, os blocos de construção para estruturas supramoleculares são cada vez mais baseados em lipídios, ácidos nucleicos ou proteínas. Em comparação com polímeros sintéticos, blocos de construção proteináceos permitem um controle preciso sobre estruturas supramoleculares emergentes6 no nível genético. A seqüência de aminoácidos primários (aa) dos blocos individuais de construção de proteínas codifica intrinsecamente as informações para o seu potencial de montagem desde o nível molecular até o nível macroscópico, bem como a forma tridimensional e as propriedades físicas da estrutura supramolecular final7.

Métodos relatados para a montagem de diferentes estruturas supramoleculares geralmente envolvem proteínas anfífilas, como proteínas sensíveis à temperatura semelhantes à elastina (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10e anfífilos de proteína artificial11. Métodos acionados de temperatura levaram à montagem de micelas4,10,12Fibras13Folhas14e vesículas9,15,16. Métodos envolvendo solventes orgânicos têm sido aplicados para a formação de vesículas dinâmicas à base de proteínas8,11,14. Até agora, protocolos aplicados para a formação de vesículas muitas vezes não têm controle de montagem sobre conjuntos de tamanho de micrômetros16,17ou têm rendimento de montagem limitado5. Além disso, algumas vesículas baseadas em ELP relataram ter prejudicado o potencial de encapsulamento12ou estabilidade limitada ao longo do tempo9. Abordando essas desvantagens, os protocolos apresentados permitem a automontagem de estruturas supramoleculares de micromedidor e submicrometro com propriedades fisioquímicas distintas, bom potencial de encapsulamento e estabilidade de longo prazo. Os ELPs anfífilos sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares, abrangendo a faixa desde coacervates esféricos e feixes de fibras torcidas altamente ordenados até vesículas unilamelares, dependendo do protocolo aplicado e das condições ambientais associadas. Grandes compartimentos à base de membrana sicular (PMBC) revelam todos os principais fenótipos, como fusão de membranas e comportamento de separação de fase análogo a lipossomos. Os PMBCs encapsulam eficientemente moléculas de carga fluorescentes quimicamente diversas que podem ser monitoradas usando microscopia de epifluorescência simples. Os domínios repetitivos de ELP utilizados neste estudo são blocos de construção atraentes para arquiteturas supramoleculares baseadas em proteínas18. A unidade de repetição do pentapeptídeo ELP (VPGVG) é conhecida por tolerar diferentes aa além de prolina na quarta posição (valina, V), preservando suas propriedades estruturais e funcionais19. O desenho de ELPs anfífilos contendo domínios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos foi realizado pela inserção de resíduos aa convidados (X) na repetição vpgxg com hidrofobicidade distinta, polaridade e carga20. Domínios anfífilos de ELP quando equipados com fenilalanina hidrofóbica (F) ou isoleucina (I) enquanto o domínio hidrofílico continha ácido glutamico carregado (E) ou arginina (R) como resíduos convidados. Uma lista de construções anfífilas elegíveis e seqüências aa correspondentes podem ser encontradas nas informações e referências suplementares8,21. Todos os blocos de construção onde equipados com pequenos corantes fluorescentes ou proteínas fluorescentes para visualização via microscopia de fluorescência. mEGFP e outras proteínas fluorescentes foram futilizadas n-terminalmente aos domínios hidrofílicos dos anfífilos ELP . Corantes orgânicos foram conjugados através da cepa livre de cobre promovida cicloadição alquina-azida (SPAAC) a um aminoácido não natural introduzido co-tradução (UAA). A incorporação co-translacional do UAApara-azidophenylanina (pAzF)22permite a modificação n-terminal do domínio eLP hidrofílico. Desta forma, o corante fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou qualquer pequena molécula fluorescente com um ciclooctyne tenso pode ser usado como sonda fluorescente. A incorporação bem sucedida do pAzF da UAA e a cicloadição do tintura via SPAAC podem ser facilmente confirmadas via LC-MS/MS devido à ionização eficiente dos peptídeos tripés correspondentes8. Este pequeno corante orgânico foi aplicado para ampliar a escolha do solvente para protocolos de montagem, uma vez que as proteínas fluorescentes são incompatíveis com a maioria dos solventes orgânicos. Os dois protocolos de montagem mais eficientes para estruturas supramoleculares desenvolvidas em nosso laboratório são descritos abaixo. O método de inchaço THF só é compatível com o ELP anfífila modificado de tintura orgânica. Em contraste, o método de extrusão de 1-butanol (BuOH) é compatível com muitas proteínas como sonda fluorescente, por exemplo, mEGFP, uma vez que o método descrito preserva totalmente a fluorescência dessas proteínas de fusão. Além disso, o encapsulamento de pequenas moléculas e comportamento de fusão vesicular funciona melhor empregando o método de extrusão BuOH.

Protocol

1. Projeto e clonagem de proteínas anfífilas semelhantes à elastina (ELPs) Clonar e projetar as construções como descrito em outros lugares8,20. Plasmids estão disponíveis mediante solicitação. 2. Expressão proteica, purificação e preparação Expressão de F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry Inocular a cultura de expressão principal da pré-cultura da noite para odia 600 de 0,3. Incu…

Representative Results

Desenvolvimento de protocolos para produção de vesículasA Figura 1 descreve os dois métodos diferentes de preparação da vesícula. O método de inchaço THF no lado esquerdo é composto de três passos sucessivos e resulta em diferentes conjuntos supramoleculares do ELP, dependendo da temperatura. Na Figura 1A imagens de microscopia de epifluorescência mostram vesículas montadas a partir de BDP-R20F20 e e…

Discussion

Uma falha ao seguir os protocolos descritos para a montagem de estruturas supramoleculares definidas leva principalmente à formação de agregados inespecíficos(Figura 2, IV) ou a anfífilos ELP-anfifilos homogeneamente distribuídos. As etapas críticas do protocolo são discutidas abaixo:

Para o alto rendimento de expressão do ELP anfífilo, uma temperatura relativamente baixa de 20°C é ótima. Para a purificação bem-sucedida da eLP anfífila, foi comprov…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao BMBF pelo apoio financeiro e ao Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) pelo fornecimento da instalação de pesquisa. Somos gratos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Califórnia, EUA por fornecer o plasmídeo pEVOL-pAzF. Agradecemos à equipe do Centro de Imagens de Vida (LIC) do Centro de Análise de Sistemas Biológicos (ZBSA) da Universidade Albert-Ludwigs-Universidade de Freiburg pela ajuda com seus recursos de microscopia confocal, e pelo excelente apoio na gravação de imagens.

Materials

1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

References

  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

View Video