إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل انقسام الخلايا في الأنسجة السليمة عن طريق المجهر الخلية الحية والثابتة باستخدام الحيوانات المنوية الميواتية Drosophila. يوضح البروتوكول كيفية عزل الخصيتان الكاملة والسليمة من يرقات دروسوفيلا والخوخ المبكر ، وكيفية معالجتها وتركيبها للتنظير المجهري.
Abstract
التحليل التجريبي للخلايا التي تنقسم في الأنسجة والأعضاء الحية والسليمة أمر ضروري لفهمنا لكيفية تكامل انقسام الخلايا مع التطور وتناط الأنسجة وعمليات المرض. الخلايا المنوية Drosophila التي تخضع للmeiosis مثالية لهذا التحليل لأن (1) اختبارات Drosophila كاملة تحتوي على الخلايا المنوية من السهل نسبيا لإعداد للميكروسسكوبية، (2) حجم الحيوانات المنوية كبيرة يجعلها مناسبة تماما للتصوير عالية الدقة، و (3) أدوات قوية Drosophila الوراثية يمكن دمجها مع في تحليل الجسم الحي. هنا ، نقدم بروتوكولًا يسهل الوصول إليه لإعداد الخصيتين الكاملتين من يرقات الانستار الثالثة Drosophila والخوخ المبكر. نحن نصف كيفية تحديد الحيوانات المنوية meiotic في الخصيتين كله أعدت وكيفية تصويرها تعيش عن طريق المجهر الفاصل الزمني. كما يتم توفير بروتوكولات التثبيت والاختبارات الكاملة المناعية. استخدام الخصية اليرقات له العديد من المزايا على البروتوكولات المتاحة التي تستخدم الخصية الكبار لتحليل الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، الخصيتين اليرقات هي أصغر وأقل ازدحاما مع الخلايا من الخصيتين الكبار، وهذا يسهل إلى حد كبير التصوير عالية الدقة من الخلايا المنوية. لإثبات هذه المزايا وتطبيقات البروتوكولات، نقدم نتائج تبين إعادة توزيع التبهيل الإندوسلي في ما يتعلق بالميكروتوبولين المغزل أثناء انقسام الخلية في صورة واحدة من الحيوانات المنوية التي تم تصويرها بواسطة المجهر confocal الفاصل الزمني. يمكن الجمع بين البروتوكولات مع التعبير عن أي عدد من البروتينات الموسومة بفلوريأو علامات العضين ، وكذلك الطفرات الجينية وغيرها من الأدوات الوراثية ، مما يجعل هذا النهج قويًا بشكل خاص لتحليل آليات تقسيم الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة والأعضاء الكاملة.
Introduction
وغالبا ما يدرس انقسام الخلية باستخدام خطوط الخلية نمت في الثقافة1. في حين أننا قد اكتسبت ثروة من البصيرة لا تقدر بثمن وفهم الآليات الأساسية من هذه الدراسات2، والخلايا التي تزرع في الثقافة لا يمكن تلخيصها تماما فيزيولوجيا انقسام الخلايا كما يحدث في سليمة ، والأنسجة الحية. على سبيل المثال ، في الأنسجة والأعضاء السليمة ، يجب تقسيم الخلايا في المكان المناسب وفي الوقت المناسب بحيث تكون الخلايا الذرية موجودة بشكل صحيح داخل الأنسجة ، بحيث يمكن أن تخضع للتمايز المناسب أو البرامج الوظيفية ، وحتى يتم تنسيق انتشار الخلايا بشكل صحيح مع نمو الأنسجة أو التوازن3. بالنسبة للخلايا التي تزرع في الثقافة من ناحية أخرى ، يتم تنظيم انقسام الخلايا بشكل عام من خلال عوامل النمو في الثقافة المتوسطة4، وبالتالي لا يمكننا أن نتعلم من هذه الخلايا كيف تؤثر العوامل البيئية في الجسم الحي مثل بنية الأنسجة أو إشارات النمو على عملية التقسيم. من المهم أيضًا ملاحظة أن العديد من خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة انقسام الخلايا ، مثل خلايا HeLa و U2OS ، كانت مشتقة من الأورام النقيلية5. لذلك ، من المرجح أن يتم تغيير العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء الأساسي لهذه الخلايا السرطانية ، مثل الآليات التنظيمية لدورة الخلية والاستقرار الكروموسومي ، مقارنة بالخلايا السليمة. الفهم الكامل لفسيولوجيا انقسام الخلية ، لذلك ، يعتمد على قدرتنا على دراسة تقسيم الخلايا في مواطنها ، في بيئات الجسم الحي التي تحافظ على الآليات التنظيمية الفسيولوجية وهندسة الأنسجة.
ويعوق التقدم في فهم كيفية عمل انقسام الخلية داخل الأنسجة والأعضاء سليمة من الصعوبات الكامنة في تحليل الجسم الحي أو الجسم الحي. أولاً، قد يكون من الصعب أو المستحيل الوصول إلى الخلايا المنقسمة للتحليل المجهري داخل الأعضاء الكبيرة أو الأنسجة السميكة. ثانياً، غالباً ما يكون من الصعب التنبؤ بالوقت الذي ستنقسم فيه الخلايا الفردية في الجسم الحي. ثالثا، قد تتدهور فسيولوجيا الأنسجة بسرعة خلال زراعة الجسم الحي السابق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طرق يمكن الوصول إليها بسهولة لتحليل الحية والثابتة من الحيوانات المنوية drosophila melanogaster لأنها تخضع لانقسامات الخلايا meiotic داخل الخصيتين سليمة تماما. هذه الخلايا مثالية لتحليل الحية، على سبيل المثال على الجسم الحي لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة مع الأساليب البصرية القياسية مثل المجهر الكونستبكي، فإنها تقسم في أوقات ومواقع يمكن التنبؤ بها، ويمكن الحفاظ على الخصيتين سليمة في ثقافة الجسم الحي على ما يصل إلى حوالي 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن خلايا الحيوانات المنوية في دروسوفيلا هي خلايا مستديرة كبيرة (قطرها حوالي 20-30 ميكرون) لا تغير الشكل عند تقسيمها، مما يجعلها مثالية للدقة العالية والتصوير الفاصل الزمني للمكونات الخلوية مثل جهاز المغزل والعضيات السيتوبلازمية. على الرغم من أن هذه الخلايا تخضع للmeiosis بدلا من الانقسام ، فإن العديد من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية متشابهة للغاية بين هاتين الآليتين لانقسام الخلايا6. جعلت هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع أدوات قوية Drosophila الوراثية، Drosophila spermatocytes نموذج يستخدم على نطاق واسع لتحليل الجسم الحي من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية بما في ذلك تشكيل المغزل والتنظيم، cytokinesis، وإعادة عرض organelle وتقسيم7،8،9،10،11.
الخلايا المنوية هي الخلايا التي هي في مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية. في دروسوفيلا، يبدأ تكوين الحيوانات المنوية بمجموعة من الخلايا الجذعية الجرثومية التي تقع في منطقة صغيرة أو “محور” في قطب واحد من الخصية12،13. تنقسم هذه الخلايا بسبب الانقسام غير المتماثل ، مما يؤدي إلى وجود نطاف واحد متمايز. الحيوانات المنوية ثم الخضوع لأربعة mitoses متزامن لإنتاج مجموعة من 16 الخلايا التي لا تزال مرتبطة ارتباطا وثيقا داخل كيس واحد. في هذه المرحلة، تنتقل الخلايا من دورة الخلايا الميطيّة إلى دورة الخلية الميّواتية ويشار إليها باسم الخلايا المنوية. الخلايا المنوية تنفق حوالي يومين إلى ثلاثة أيام في مرحلة G2 الموسعة من دورة الخلية، والتي تنمو بشكل كبير والخضوع لتغيرات الخلوي استعدادا للقسمين meiotic والحيوانات المنوية اللاحقة13،14. المجموعة بأكملها من 16 الخلايا المنوية داخل كيس واحد ثم أدخل الانقسام meiotic الأولى في نفس الوقت. وهكذا، يمكن أن يتم التصوير العديد من الحيوانات المنوية meiotic في وقت واحد لأنها تتحرك من خلال انقسام الخلية. يشرع القسم الميوتيكي الأول لمدة 1.5 ساعة تقريبًا ويتبعها على الفور تقريبًا القسم الميوطي الثاني ، مما ينتج عنه 64 من الحيوانات المنوية الإجمالية التي تستمر في التفريق إلى الحيوانات المنوية الناضجة.
ميزة فريدة من نوعها لاستخدام الخلايا المنوية لدراسة انقسام الخلايا في الأنسجة الحية وسليمة هي أن مجموعات أو الخراجات من الخلايا تتقدم باستمرار من خلال مراحل مختلفة من تكوين الحيوانات المنوية، والخلايا في جميع مراحل تكوين الحيوانات المنوية يمكن عادة تحديدها في أي الخصية معينة (انظر الشكل 3A). لذلك ، من السهل نسبيًا العثور على خلايا ميوتيكية في الخصيتين الكاملتين. نحن نركز بشكل عام تحليلاتنا على الأول بدلاً من meiosis الثاني لأن هذه الخلايا أكبر بكثير وأكثر قابلية للتصوير عالي الدقة ، ولكن العملية بأكملها التي تشمل كلا القسمين meiotic يمكن تصويرها بنجاح. تجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول العام لإعداد الخصية والثقافة يمكن استخدامها لتحليل العمليات الأخرى لتكوين الحيوانات المنوية كذلك، مثل الخلايا الجذعية mitotic في وقت سابق أو الانقسامات المنوية أو التغيرات الخلوية التي تحدث كما الحيوانات المنوية تنضج في الحيوانات المنوية15. يتم الحفاظ على العديد من هذه الجوانب من تكوين الحيوانات المنوية بشكل كبير بين دروسوفيلا والبشر16.
الخلايا المنوية Drosophila تبدأ في الوصول إلى مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية خلال المرحلة الثالثة من اليرقات instar من تطوير Drosophila 13. لذلك ، يمكن استخدام الخصيتين المعزولات من مراحل دورة الحياة بدءًا من يرقات الإنستار الثالثة بما في ذلك الخوخ والبالغين لتحليل تقسيم الخلايا المنوية. تتوفر العديد من البروتوكولات الممتازة لاستخراج الخصيات من الذباب الذكور البالغين للتحليل الحي والثابت لتكوين الحيوانات المنوية17،18،19. قد تكون هذه البروتوكولات مفضلة لدراسة المراحل المتأخرة من تكوين الحيوانات المنوية أو إذا كان يجب استخدام العلامات الوراثية التي لا تظهر إلا لدى البالغين. يركز البروتوكول بدلاً من ذلك على إعداد الخصية من اليرقات والخوخ المبكر ، لأن الخصيتين في هذه المراحل لها العديد من المزايا التي ترتبط على وجه التحديد بتحليل انقسام الخلايا عن طريق التحليل الدقيق العالي والمجهر الفاصل زمنيًا. أولاً ، الخصيتان من اليرقات والخوخ أصغر من تلك التي من البالغين ، والخلايا داخل الجهاز أقل ازدحامًا. وبسبب هذا، يمكن في كثير من الأحيان تقسيم الخلايا المنوية يمكن أن تكون صورة بالقرب من السطح الخارجي للاختبارات اليرقات، دون الحاجة إلى اختراق من خلال طبقات متعددة من الأنسجة المتناثرة الضوء. ثانياً، تتحرك خصيّات البالغين بشكل إيقاعي بسبب تقلصات الأعضاء الملحقة، وهذه الحركات تجعل تصوير الخلايا الفردية ينطوي على ضيق زمني. وثالثاً، تكون اختبارات اليرقات مفيدة عند دراسة الطفرات الجينية التي تسبب الفتك الجروية أو البالغة. تم تحسين أساليبنا لثقافة طويلة الأجل من الخصيتين على مرحلة المجهر ، مما يسمح بتصوير جولات متعددة من انقسام الخلايا أو تطور الخلايا الفردية من خلال مراحل متعددة من تكوين الحيوانات المنوية في نفس الإعداد. كما أننا نصف بروتوكول لتثبيت ومناعة الخصيتين بأكملها. وعموما، بروتوكولاتنا مفيدة بشكل خاص لأولئك المهتمين في دراسة انقسام الخلايا في الأنسجة سليمة، والقدرة على الجمع بين تحليل الحيوانات المنوية مع أدوات الحمض العضلي ة القابلة للاستغناء عن الأدوات الوراثية دروسوفيلا يجعل هذا النهج قوية خاصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا بروتوكولًا لإعداد اختبارات اليرقات أو الجرو المبكر ة Drosophila ، الأمثل للتصوير الحي على المدى الطويل لانقسام خلايا الحيوانات المنوية. هذا هو وسيلة قوية لتحليل انقسام الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة سليمة. يتم توسيع قوة هذه الطريقة عند دمجها مع الأدوات الوراثية Drosophila</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بدء الأموال لJ.T.S.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. . Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
