Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken
Summary
Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.
Abstract
Stereotactische chirurgie is een essentieel hulpmiddel in het moderne neurowetenschappelijke laboratorium. Het vermogen om moeilijk bereikbare hersengebieden nauwkeurig en nauwkeurig te targeten, vormt echter nog steeds een uitdaging, vooral bij het richten op hersenstructuren langs de middellijn. Deze uitdagingen omvatten het vermijden van de superieure sagittale sinus en de derde ventrikel en het vermogen om zich consequent te richten op selectieve en discrete hersenkernen. Bovendien vertrouwen meer geavanceerde neurowetenschappelijke technieken (bijv. Optogenetica, vezelfotometrie en beeldvorming met twee fotonen) op gerichte implantatie van belangrijke hardware in de hersenen, en ruimtelijke beperkingen zijn een veel voorkomende belemmering. Hier wordt een aanpasbaar protocol gepresenteerd voor stereotactische targeting van hersenstructuren van knaagdieren met behulp van een schuine coronale benadering. Het kan worden aangepast aan 1) muis- of rattenmodellen, 2) verschillende neurowetenschappelijke technieken en 3) meerdere hersengebieden. Als representatief voorbeeld omvat het de berekening van stereotactische coördinaten voor het richten van de hypothalamische ventromediale kern (VMN) van de muis voor een optogenetisch remmingsexperiment. Deze procedure begint met de bilaterale micro-injectie van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat codeert voor een lichtgevoelig chloridekanaal (SwiChR++) naar een Cre-afhankelijk muismodel, gevolgd door de schuine bilaterale implantatie van fiberoptische canules. Met behulp van deze benadering tonen de bevindingen aan dat activering van een subset van VMN-neuronen nodig is voor intacte glucose-contraregulerende reacties op insuline-geïnduceerde hypoglykemie.
Introduction
Neurale controle van gedrag, voeding en metabolisme omvat coördinatie van zeer complexe, integratieve en redundante neurocircuits. Een drijvend doel van het neurowetenschappelijke veld is om de relatie tussen neuronale circuitstructuur en functie te ontleden. Hoewel klassieke neurowetenschappelijke hulpmiddelen (d.w.z. laesies, lokale farmacologische injecties en elektrische stimulatie) vitale kennis hebben blootgelegd over de rol van specifieke hersengebieden die gedrag en metabolisme regelen, worden deze hulpmiddelen beperkt door hun gebrek aan specificiteit en omkeerbaarheid1.
Recente ontwikkelingen op het gebied van neurowetenschappen hebben het vermogen om de circuitfunctie te ondervragen en te manipuleren op een celtypespecifieke manier met een hoge spatiotemporale resolutie aanzienlijk verbeterd. Optogenetische2- en chemogenetische3-benaderingen maken bijvoorbeeld de snelle en omkeerbare manipulatie van activiteit in genetisch gedefinieerde celtypen van vrij bewegende dieren mogelijk. Optogenetica omvat het gebruik van lichtgevoelige ionkanalen, channelrhodopsinen genoemd, om neuronale activiteit te beheersen. De sleutel tot deze techniek is de genafgifte van channelrhodopsine en een lichtbron om de opsine te activeren. Een veel voorkomende strategie voor genafgifte is door een combinatie van 1) genetisch gemanipuleerde muizen die Cre-recombinase tot expressie brengen in discrete neuronen, en 2) Cre-afhankelijke virale vectoren die coderen voor channelrhodopsine.
Hoewel optogenetica een elegant, zeer nauwkeurig middel biedt om neuronale activiteit te beheersen, is de methode afhankelijk van succesvolle stereotactische micro-injectie van de virale vector en fiberoptische plaatsing in een gedefinieerd hersengebied. Hoewel stereotactische procedures gemeengoed zijn binnen het moderne neurowetenschappelijke laboratorium (en er zijn verschillende uitstekende protocollen die deze procedure beschrijven)4,5,6, in staat zijn om consequent en reproduceerbaar discrete hersengebieden langs de middellijn te richten (d.w.z. de middelmatige hypothalamus, een hersengebied dat cruciaal is voor de regulatie van homeostatische functies7) biedt extra uitdagingen. Deze uitdagingen omvatten het vermijden van de superieure sagittale sinus, derde ventrikel en aangrenzende hypothalamische kernen. Bovendien zijn er aanzienlijke ruimtelijke beperkingen aan de bilaterale implantatie van hardware die nodig is voor remmingsstudies. Met deze uitdagingen in gedachten presenteert dit protocol hierin een aanpasbare procedure voor het richten op discrete hersengebieden via een schuine stereotactische benadering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recente ontwikkelingen in de neurowetenschappen hebben geavanceerd inzicht en begrip in de activiteit en functie van hersenneurocircuits ondersteund. Dit omvat de toepassing van optogenetische en chemogenetische technologieën om discrete neuronale populaties en hun projectieplaatsen in vivo te activeren of tot zwijgen te brengen. Meer recent omvatte dit de ontwikkeling van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (bijv. GCaMP, RCaMP) en andere fluorometrische biosensoren (bijv. Dopamine, noradrenaline) voor in vivo regis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) subsidies F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), een American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 aan G.J.M.) en het door NIDDK gefinancierde Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) en Diabetes, Obesity and Metabolism Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) aan de Universiteit van Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
