Approche stéréotaxique angulaire adaptable pour des techniques de neuroscience polyvalentes
Summary
Décrite ici est une procédure stéréotaxique qui peut cibler des régions cérébrales difficiles et difficiles à atteindre (en raison de limitations spatiales) en utilisant une approche coronale inclinée. Ce protocole est adaptable aux modèles de souris et de rats et peut être appliqué à diverses applications neuroscientifiques, y compris l’implantation de canules et les microinjections de constructions virales.
Abstract
La chirurgie stéréotaxique est un outil essentiel dans le laboratoire de neurosciences moderne. Cependant, la capacité de cibler avec précision et précision les régions cérébrales difficiles à atteindre présente toujours un défi, en particulier lorsqu’il s’il s’art de cibler les structures cérébrales le long de la ligne médiane. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur et du troisième ventricule et la capacité de cibler systématiquement les noyaux cérébraux sélectifs et discrets. En outre, les techniques de neurosciences plus avancées (par exemple, l’optogénétique, la photométrie des fibres et l’imagerie à deux photons) reposent sur l’implantation ciblée de matériel important dans le cerveau, et les limitations spatiales sont un obstacle courant. Présenté ici est un protocole modifiable pour le ciblage stéréotaxique des structures cérébrales des rongeurs en utilisant une approche coronale inclinée. Il peut être adapté à 1) des modèles de souris ou de rats, 2) diverses techniques de neurosciences et 3) plusieurs régions du cerveau. À titre d’exemple représentatif, il comprend le calcul des coordonnées stéréotaxiques pour le ciblage du noyau ventromédian hypothalamique (VMN) de souris pour une expérience d’inhibition optogénétique. Cette procédure commence par la micro-injection bilatérale d’un virus adéno-associé (AAV) encodant un canal chlorure sensible à la lumière (SwiChR++) sur un modèle murin dépendant de Cre, suivie de l’implantation bilatérale inclinée de canules à fibres optiques. En utilisant cette approche, les résultats montrent que l’activation d’un sous-ensemble de neurones VMN est nécessaire pour les réponses antirégulatrices du glucose intactes à l’hypoglycémie induite par l’insuline.
Introduction
Le contrôle neuronal du comportement, de l’alimentation et du métabolisme implique la coordination de neurocircuits hautement complexes, intégratifs et redondants. L’un des ent objectifs du domaine des neurosciences est de disséquer la relation entre la structure et la fonction des circuits neuronaux. Bien que les outils classiques des neurosciences (c’est-à-dire les lésions, les injections pharmacologiques locales et la stimulation électrique) aient révélé des connaissances vitales concernant le rôle de régions cérébrales spécifiques qui contrôlent le comportement et le métabolisme, ces outils sont limités par leur manque de spécificité et de réversibilité1.
Les progrès récents dans le domaine des neurosciences ont considérablement amélioré la capacité d’interroger et de manipuler la fonction du circuit d’une manière spécifique au type cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les approches optogénétiques2 etchimiogénétiques 3, par exemple, permettent la manipulation rapide et réversible de l’activité dans des types cellulaires génétiquement définis d’animaux en mouvement libre. L’optogénétique implique l’utilisation de canaux ioniques sensibles à la lumière, appelés channelrhodopsines, pour contrôler l’activité neuronale. La clé de cette technique est l’administration génique de la channelrhodopsine et une source de lumière pour activer l’opsine. Une stratégie courante pour l’administration de gènes consiste à combiner 1) des souris génétiquement modifiées exprimant la Cre-recombinase dans des neurones discrets et 2) des vecteurs viraux dépendants de la Cre codant pour la channelrhodopsine.
Alors que l’optogénétique fournit un moyen élégant et très précis de contrôler l’activité neuronale, la méthode dépend de la micro-injection stéréotaxique réussie du vecteur viral et du placement de la fibre optique dans une région définie du cerveau. Bien que les procédures stéréotaxiques soient courantes dans le laboratoire de neurosciences moderne (et il existe plusieurs excellents protocoles décrivant cette procédure),4,5,6, être capable de cibler de manière cohérente et reproductible des régions cérébrales discrètes le long de la ligne médiane (c’est-à-dire l’hypothalamus médio-sasal, une zone du cerveau essentielle à la régulation des fonctions homéostatiques7) présente des défis supplémentaires. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur, du troisième ventricule et des noyaux hypothalamiques adjacents. En outre, il existe des limites spatiales importantes à l’implantation bilatérale du matériel nécessaire aux études d’inhibition. Avec ces défis à l’esprit, ce protocole présente ici une procédure modifiable pour cibler des régions cérébrales discrètes via une approche stéréotaxique inclinée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les progrès récents des neurosciences ont soutenu une compréhension et une compréhension avancées de l’activité et de la fonction des neurocircuits cérébraux. Cela comprend l’application de technologies optogénétiques et chimiogénétiques pour activer ou réduire au silence des populations neuronales discrètes et leurs sites de projection in vivo. Plus récemment, cela a inclus le développement d’indicateurs de calcium génétiquement codés (par exemple, GCaMP, RCaMP) et d’autres biocapteurs fluorom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un prix de science fondamentale innovante de l’American Diabetes Association (#1-19-IBS-192 à G.J.M.) et le Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), le Diabetes Research Center (DK-017047) et diabetes, Subvention d’entraînement à l’obésité et au métabolisme T32 DK0007247 (T.H.M) à l’Université de Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
