Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım
Summary
Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.
Abstract
Stereotaktik cerrahi, modern sinirbilim laboratuvarında önemli bir araçtır. Bununla birlikte, ulaşılması zor beyin bölgelerini tam ve doğru bir şekilde hedefleme yeteneği, özellikle orta hat boyunca beyin yapılarını hedeflerken hala bir zorluk teşkil etmektedir. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüs ve üçüncü ventrikülden kaçınmak ve seçici ve ayrık beyin çekirdeklerini sürekli olarak hedefleme yeteneği yer almaktadır. Ek olarak, daha gelişmiş sinirbilim teknikleri (örneğin, optogenetik, lifli fotometri ve iki foton görüntüleme) beyne önemli donanımların hedefli implantasyonuna dayanır ve mekansal sınırlamalar yaygın bir engeldir. Burada, açılı bir koronal yaklaşım kullanılarak kemirgen beyin yapılarının stereotaktik olarak hedeflimi için değiştirilebilir bir protokol sunulmaktadır. 1) fare veya sıçan modellerine, 2) çeşitli sinirbilim tekniklerine ve 3) birden fazla beyin bölgesine uyarlanabilir. Temsili bir örnek olarak, bir optogenetik inhibisyon deneyi için fare hipotalamik ventromedial çekirdeğinin (VMN) hedeflanması için stereotaktik koordinatların hesaplanmasını içerir. Bu prosedür, adeno ilişkili bir virüsün (AAV) ışığa duyarlı bir klorür kanalını (SwiChR++) Cre’ye bağımlı bir fare modeline kodlaması ve ardından fiberoptik kanonun açılı bilateral implantasyonu ile başlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bulgular insülin kaynaklı hipoglisemiye karşı sağlam glikoz karşı-gülatör yanıtları için VMN nöronlarının bir alt kümesinin aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.
Introduction
Davranış, beslenme ve metabolizmanın sinirsel kontrolü, son derece karmaşık, bütünleştirici ve gereksiz nörosürücülerin koordinasyonunu içerir. Nörobilim alanının itici bir amacı, nöronal devre yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi parçalamaktır. Klasik sinirbilim araçları (yani lezyonlama, lokal farmakolojik enjeksiyonlar ve elektriksel stimülasyon) davranışı ve metabolizmayı kontrol eden belirli beyin bölgelerinin rolü hakkında hayati bilgileri ortaya çıkarmış olsa da, bu araçlar özgüllük ve geri döndürülebilirlik eksikliği ile sınırlıdır1.
Nörobilim alanındaki son gelişmeler, devre fonksiyonunu yüksek mekansal çözünürlükle hücre tipi spesifik bir şekilde sorgulama ve manipüle etme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Örneğin optogenetik2 ve kemogenetik3 yaklaşımları, serbestçe hareket eden hayvanların genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde aktivitenin hızlı ve geri dönüşümlü manipülasyonuna izin verir. Optogenetik, nöronal aktiviteyi kontrol etmek için channelrhodopsins olarak adlandırılan ışığa duyarlı iyon kanallarının kullanımını içerir. Bu tekniğin anahtarı, channelrhodopsin’in gen iletimi ve opsin’i aktive etmek için bir ışık kaynağıdır. Gen iletimi için ortak bir strateji, 1) ayrı nöronlarda Cre-rekombinaz ifade eden genetik olarak tasarlanmış fareler ve 2) Channelrhodopsin kodlaması için cre-dependent viral vektörler kombinasyonudur.
Optogenetik nöronal aktiviteyi kontrol etmek için zarif, son derece hassas bir araç sağlarken, yöntem viral vektörün başarılı stereotaktik mikroenjeksiyonuna ve tanımlanmış bir beyin bölgesine fiberoptik yerleştirmeye dayatılır. Stereotaktik prosedürler modern sinirbilim laboratuvarında yaygın olmasına rağmen (ve bu prosedürü tanımlayan birkaç mükemmel protokol vardır)4,5,6, orta hat boyunca ayrı beyin bölgelerini tutarlı ve tekrar tekrar hedefleyebilmek (yani, homeostatik fonksiyonların düzenlenmesi için kritik bir beyin alanı olan mediobaz hipotalamus) ek zorluklar sunar. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüsten, üçüncü ventrikülden ve bitişik hipotalamik çekirdeklerden kaçınmak yer almaktadır. Ek olarak, inhibisyon çalışmaları için gerekli olan donanımın bilateral implantasyonunda önemli mekansal sınırlamalar vardır. Bu zorlukları göz önünde bulundurarak, bu protokol burada açılı bir stereotaktik yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için değiştirilebilir bir prosedür sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nörobilimdeki son gelişmeler, beyin nörositlerinin aktivitesi ve işlevi hakkında ileri içgörü ve anlayışı desteklemiştir. Bu, ayrık nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyon alanlarını in vivo etkinleştirmek veya susturmak için optogenetik ve kemogenetik teknolojilerin uygulanmasını içerir. Daha yakın zamanlarda, bu, serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış bir hücre tipinde nöronal aktivitenin in vivo kaydı için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (örneğin, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) tarafından F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M .), Amerikan Diyabet Derneği Yenilikçi Temel Bilim Ödülü (#1-19-IBS-192’den G.J..M.)’ye) ve NIDDK destekli Beslenme Obezitesi Araştırma Merkezi (DK-035816), Diyabet Araştırma Merkezi (DK-017047) ve Diyabet, Washington Üniversitesi’nde Obezite ve Metabolizma Eğitimi T32 DK0007247 (T.H.M) hibesi.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
