使用接近连接测定在C.elegans Germline中对核糖蛋白复合体装配的实地检测
Summary
该协议演示了使用接近连接测定来探测在C. elegans生殖系中原位的蛋白质-蛋白质相互作用。
Abstract
了解蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 的何时何地发生对于了解细胞中的蛋白质功能以及开发等更广泛的过程受到的影响至关重要。Caenorhabditis elegans生殖系是研究与干细胞、梅氏病和发育调控相关的PPI的一种很好的模型系统。有多种开发良好的技术，允许感兴趣的蛋白质被标出标准抗体来识别，使该系统有利于接近结扎测定（PLA）反应。因此，PLA 能够比替代方法更有效地以空间和时间方式显示 PPI 在生殖系中的位置。此处描述的是一种用于应用和定量该技术以在C. elegans生殖系中探测 PPI 的协议。
Introduction
据估计，超过80%的蛋白质与其他分子有相互作用1，这强调PPI对于在细胞2中执行特定生物功能的重要性。一些蛋白质作为中心，促进组装更大的复合物，这是细胞生存所必需的1。这些中心调解多个PPI，并帮助组织蛋白质进入一个网络，促进细胞3中的特定功能。蛋白质复合物的形成也受到生物背景的影响，如存在或缺乏特定的相互作用伙伴4、细胞信号事件和细胞的发育阶段。
C. elegans通常用作各种研究（包括发育）的模型有机体。这种动物的简单解剖由几个器官组成，包括果子、肠和透明角质，这有利于蠕虫发育的分析。居住在哥纳的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟成配体5，发育成胚胎，并最终成为下一代后代的一个很好的工具。生殖系的远端区域包含一池自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开这个利基时，它们进入微离子pachytene，并最终在年轻的成人阶段发展成卵母细胞（图1）。该生殖系的发育方案通过不同的机制受到严格监管，包括由RNA结合蛋白（RBPs）6促进的转录后监管网络。6PPI 对于这一监管活动非常重要，因为限制性商业惯例与其他辅助因素相关联以发挥其职能。
有几种方法可用于探测蠕虫中的 PPI，但每种方法都有独特的限制。体内免疫沉淀（IP）可用于从整个蠕虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物;但是，此方法并不指示 PPI 在蠕虫中的位置。此外，在特定的发育阶段或有限数量的细胞中，暂时性且仅形成的蛋白质复合物很难通过共同免疫沉淀来恢复。最后，IP实验需要解决在压解后蛋白质复杂重新分类以及蛋白质在亲和力基质上的非特异性保留后的问题。
PPI原位检测的替代方法是联合免疫染色、Fürster共振能量转移（FRET）和双分子荧光补充（BiFC）。联合免疫染色依赖于同时检测固定蠕虫组织中感兴趣的两种蛋白质，以及信号共定位程度的测量。使用超分辨率显微镜，它提供了比标准显微镜7更多的细节，有助于更严格地测试蛋白质共定位超过衍射限制屏障200-300 nm8。然而，使用常规和超高分辨率显微镜的共免疫染色最适合具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于漫射分布的交互伙伴来说，它的信息量要少得多。测量基于重叠的信号的共定位并不能提供有关蛋白质是否彼此复杂99、1010的准确信息。
此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共同免疫染色不是定量的，因此很难确定这种相互作用是否显著。FRET 和 BiFC 都是基于荧光的技术。FRET依赖于标记感兴趣的蛋白质与荧光蛋白（FP），具有光谱重叠，其中能量从一个FP（捐赠者）转移到另一FP（接受者）11。这种能量的非辐射转移导致接受方FP的荧光，可以在其各自的发射波长下检测到。BiFC是基于在体内重组荧光蛋白。它需要将GFP分成两个互补片段，如螺旋1-10和螺旋1112，然后融合到两个感兴趣的蛋白质。如果这两种蛋白质相互作用，GFP的互补片段就变得足够接近折叠和组装，重建GFP荧光。重组后的 GFP 被直接观察为荧光，并指示 PPI 发生的位置。
因此，FRET 和 BiFC 都依赖于大型荧光标签，这些荧光标签会破坏标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要大量且可比较地表达标记的蛋白质才能获得准确的数据。FRET 可能不适合一个伙伴超过另一个伙伴的实验，这可能导致高背景13。还应避免在 BiFC 实验中过度表达，因为这可能导致非特异性装配14导致背景增加。这两种技术都需要优化标记蛋白的表达和成像条件，这可能会延长完成实验所需的时间。
接近连接测定 （PLA） 是一种替代方法，可以解决上述技术的限制。PLA利用识别感兴趣的蛋白质（或其标签）的主要抗体。这些主要抗体然后由含有寡核苷酸探针的二次抗体结合，当在40纳米（或较短）距离15内时，这些抗体可以相互杂交。由此产生的杂交DNA通过PCR反应被放大，由补充DNA的探测器检测到。这将导致由显微镜可视化的 foci。该技术可以在复杂组织（即蠕虫腺体）中现场检测PPI，该组织为在发育和分化的不同阶段包含细胞的装配线。使用 PLA，PPI 可以直接可视化到固定蠕虫子，这有利于调查 PPI 是否在特定开发阶段发生。PLA 提供更高的 PPI 分辨率，而不是基于联合本地化的检测，这是进行精确测量的理想选择。如果使用，超高分辨率显微镜有可能提供有关PLA foci在细胞内位置的更精细的细节。另一个优点是，PLA反应产生的方法可以通过基于ImageJ的分析工作流进行计数，使这种技术具有定量性。
LC8系列的代宁光链最初被描述为Dynein电机复合体16的子单元，并假设作为货物适配器。自首次发现以来，LC8除了Dynein马达,复合体17、18、19、20,18,19外，还发现多种蛋白质复合物。20扫描含有LC8相互作用图案的蛋白质序列19表明LC8可能与各种不同的蛋白质有许多相互作用17，18，19，20，21，22。17,18,19,20,21,22因此，LC8家族蛋白现在被认为是中心，帮助促进组装较大的蛋白质复合物19，22，如内部紊乱蛋白质的组装21。19,
一种C.elegansLC8系列蛋白质，代宁光链-1（DLC-1），广泛表达在许多组织中，不丰富在特定亚细胞结构23，24。,24因此，由于多种原因，在C.elegans中确定DLC-1体内的体内伙伴是具有挑战性的：1） 共同免疫沉淀并不指示发生相互作用的组织源;2） 特定伴侣的有限表达或瞬态相互作用可能妨碍通过共同免疫沉淀检测相互作用的能力;和 3） DLC-1 的漫反射通过共同免疫染色导致与潜在伙伴蛋白的非特异性重叠。基于这些挑战，PLA 是测试与 DLC-1在体内交互的理想方法。
此前有报道称，DLC-1与RNA结合蛋白（BPS）FBF-223和GLD-125直接相互作用，并作为共同因子。23 25我们的工作支持作为中心蛋白的DLC-1模型，并建议DLC-1促进一个超越Dynein19，22,22的交互网络。使用 GST 下拉测定，已识别一个新的 DLC-1 交互 RBP 名为 OMA-126。OMA-1对卵母细胞生长和成熟很重要27，并与一些转化抑制剂和活化剂28一起功能。虽然FBF-2和GLD-1分别表达在干细胞和环太平洋区域，OMA-1在从卵母细胞27的生殖系中漫射（图1）。这表明DLC-1在哥纳德的不同区域与限制性商业惯例形成复合体。还发现，在体外观察到的DLC-1和OMA-1之间的直接相互作用并没有通过体内IP恢复。人民解放军已经成功地作为另一种方法，进一步研究这种相互作用在C.elegans生殖系，结果表明，PLA可用于探索许多其他PPI在蠕虫。
Protocol
Representative Results
Discussion
在研究C.elegans生殖系中的PPI时，PLA提供的与共同免疫染色相比提供的更高分辨率，可以对生殖系中发生相互作用的位置进行可视化和定量。此前有报道称，DLC-1使用体外GST下拉测定26直接与OMA-1相互作用;然而，这种相互作用并没有通过体内下拉恢复。3xFLAG的荧光共免疫染色：:DLC-1;OMA-1：GFP生殖系显示DLC-1和OMA-1的表达模式重叠;然而，没有迹象表明它们的相互作用发生?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究中使用的一些线虫菌株是由国家卫生研究院资助的卡诺哈卜炎遗传学中心提供的（P40OD010440）。在国立卫生研究院奖 P20GM103546 和 S10OD021806 的支持下，蒙大拿大学生物光谱核心研究实验室进行了共聚焦显微镜。这项工作得到了NIH向E.V.授予GM109053的部分支持，美国心脏协会奖学金18PRE34070028资助了X.W.，蒙大拿州科学院授予了X.W.资助者没有参与研究设计或撰写报告。我们感谢埃伦贝克先生的讨论。
Materials
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
References
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