Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.
Zu verstehen, wann und wo Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) auftreten, ist entscheidend für das Verständnis der Proteinfunktion in der Zelle und wie breitere Prozesse wie die Entwicklung beeinflusst werden. Die Caenorhabditis elegans Keimbahn ist ein großartiges Modellsystem zur Untersuchung von PPI, die mit der Regulierung von Stammzellen, Meiose und Entwicklung zusammenhängen. Es gibt eine Vielzahl von gut entwickelten Techniken, die es ermöglichen, Proteine von Interesse für die Erkennung durch Standardantikörper zu kennzeichnen, was dieses System vorteilhaft für Proximity Ligation Assay (PLA) Reaktionen macht. Dadurch kann die PLA zeigen, wo PPI räumlich und zeitlich in Keimlinien auftreten, effektiver als alternative Ansätze. Hier wird ein Protokoll zur Anwendung und Quantifizierung dieser Technologie zur Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn beschrieben.
Über 80% der Proteine haben schätzungsweise Wechselwirkungen mit anderen Molekülen1, was unterstreicht, wie wichtig PPI für die Ausführung spezifischer biologischer Funktionen in der Zelle2sind. Einige Proteine fungieren als Naben, die die Montage größerer Komplexe erleichtern, die für das Zellüberleben notwendig sind1. Diese Hubs vermitteln mehrere PPIs und helfen, Proteine in einem Netzwerk zu organisieren, das bestimmte Funktionen in einer Zelle3erleichtert. Die Bildung von Proteinkomplexen wird auch durch den biologischen Kontext beeinflusst, wie das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer interagierender Partner4, Zellsignalereignisse und Entwicklungsstadium einer Zelle.
C. elegans wird häufig als Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien verwendet, einschließlich der Entwicklung. Die einfache Anatomie dieses Tieres besteht aus mehreren Organen, einschließlich der Gonaden, des Darms und der transparenten Nagelhaut, was die Analyse der Wurmentwicklung erleichtert. Die Keimbahn, die sich in der Gonade befindet, ist ein großartiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Keimbahnstammzellen zu Gameten5 reifen, die sich zu Embryonen und schließlich zur nächsten Generation von Nachkommen entwickeln. Der distale Spitzenbereich der Keimbahn enthält einen Pool von sich selbst erneuernden Stammzellen (Abbildung 1). Wenn Stammzellen die Nische verlassen, gelangen sie in das meiotische Pachyten und entwickeln sich schließlich im jungen Erwachsenenstadium zu Eizellen(Abbildung 1). Dieses Entwicklungsprogramm in der Keimbahn wird durch verschiedene Mechanismen streng reguliert, einschließlich eines post-transkriptionspolitischen regulatorischen Netzwerks, das durch RNA-bindende Proteine (RBPs)6erleichtert wird. PPI sind für diese Regulierungstätigkeit wichtig, da RBPs mit anderen Kofaktoren zusammenarbeiten, um ihre Funktionen auszuüben.
Es gibt mehrere Ansätze, die verwendet werden können, um nach PPIs im Wurm zu suchen, aber jeder hat eindeutige Einschränkungen. In vivo Immunpräzipitation (IP) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Komplexe aus ganzen Wurmextrakten zu isolieren; Dieser Ansatz gibt jedoch nicht an, wo der PPI im Wurm auftritt. Darüber hinaus können Proteinkomplexe, die vorübergehend sind und sich nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums oder in einer begrenzten Anzahl von Zellen bilden, durch Co-Immunpräzipation nur schwer zu erholen sein. Schließlich müssen IP-Experimente die Bedenken der Proteinkomplex-Neusortierung nach Lyse und unspezifische Retention von Proteinen auf der Affinitätsmatrix ansprechen.
Alternative Ansätze zur In-situ-Detektion von PPI sind Co-Immunostaining, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC). Co-Immunostaining beruht auf dem gleichzeitigen Nachweis von zwei Proteinen von Interesse in festem Wurmgewebe und der Messung des Ausmaßes der Signalkolokalisierung. Der Einsatz der hochauflösenden Mikroskopie, die detaillierter als die Standardmikroskopie7bietet, hilft, die Proteinkolokalisierung über die beugungsbegrenzte Barriere von 200-300 nm8hinaus strenger zu testen. Die Ko-Immunostainierung mit konventioneller und superhochauflösender Mikroskopie eignet sich jedoch am besten für Proteine mit genau definierten Lokalisierungsmustern. Im Gegensatz dazu wird es für diffus verteilte interagierende Partner viel weniger informativ. Die Messung der Kolokalisierung von Signalen auf der Grundlage von Überlappungen liefert keine genauen Informationen darüber, ob die Proteine komplex miteinander sind9,10.
Darüber hinaus sind Co-Immunpräzipation und Co-Immunostaining von Protein-Protein-Komplexen nicht quantitativ, was es schwierig macht, festzustellen, ob solche Wechselwirkungen signifikant sind. FRET und BiFC sind beide fluoreszierende Techniken. FRET stützt sich auf die Kennzeichnung von Proteinen von Interesse mit fluoreszierenden Proteinen (FPs), die spektrale Überlappung haben, bei der Energie von einem RP (Spender) an ein anderes RP (Akzeptor) übertragen wird11. Diese nicht-radiotive Energieübertragung führt zu einer Fluoreszenz des Akzeptor-FP, die bei seiner jeweiligen Emissionswellenlänge nachgewiesen werden kann. BiFC basiert auf der Rekonstitution eines fluoreszierenden Proteins in vivo. Es beinhaltet die Aufteilung von GFP in zwei komplementäre Fragmente, wie Helices 1-10 und Helix 1112, die dann zu zwei Proteinen von Interesse verschmolzen werden. Wenn diese beiden Proteine interagieren, werden die komplementären Fragmente von GFP in der Nähe nahe genug, um sich zu falten und zu montieren, wodurch das GFP-Fluorophor wieder vorhanden ist. Rekonstituiertes GFP wird dann direkt als Fluoreszenz beobachtet und gibt an, wo ein PPI aufgetreten ist.
Daher sind sowohl FRET als auch BiFC auf große fluoreszierende Tags angewiesen, die die Funktion des markierten Proteins stören können. Darüber hinaus benötigen FRET und BiFC eine reichliche und vergleichbare Expression der markierten Proteine, um genaue Daten zu erhalten. FRET ist möglicherweise nicht für Experimente geeignet, bei denen ein Partner über dem anderen liegt, was zu einem hohen Hintergrund führen kann13. Auch eine Überexpression in BiFC-Experimenten sollte vermieden werden, da dies zu einer unspezifischen Assembly14 führen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führt. Beide Techniken erfordern eine Optimierung der Expression und der bildgebenden Bedingungen der markierten Proteine, was die Zeit verlängern kann, die für die Abschluss von Experimenten erforderlich ist.
Der Proximity Ligation Assay (PLA) ist ein alternativer Ansatz, der die Grenzen der oben genannten Techniken angehen kann. PLA nutzt primäre Antikörper, die die Proteine von Interesse (oder ihre Tags) erkennen. Diese primären Antikörper werden dann durch sekundäre Antikörper gebunden, die Oligonukleotid-Sonden enthalten, die sich innerhalb eines Abstands von 40 nm (oder kürzer)15miteinander hybridisieren können. Die resultierende hybridisierte DNA wird durch eine PCR-Reaktion verstärkt, die von Sonden nachgewiesen wird, die die DNA ergänzen. Daraus ergeben sich Brennpunkte, die mit einem Mikroskop visualisiert werden. Diese Technologie kann PPI vor Ort in komplexen Geweben (d. h. dem Wurmgonaden) erkennen, der als Fließband organisiert ist, das Zellen in verschiedenen Entwicklungs- und Differenzierungsstadien enthält. Mit PLA können PPIs direkt in einem festen Wurmgonaden visualisiert werden, was vorteilhaft für die Untersuchung ist, ob PPI in einer bestimmten Entwicklungsphase auftreten. PLA bietet eine höhere Auflösung von PPIs im Gegensatz zu co-localization-basierten Assays, die ideal für präzise Messungen sind. Wenn sie verwendet wird, hat die superhochauflösende Mikroskopie das Potenzial, detailliertere Details über die Position von PLA-Brennpunkten innerhalb einer Zelle zu liefern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die brennpunkteherreichen PLA-Reaktionen durch einen ImageJ-basierten Analyse-Workflow gezählt werden können, was diese Technik quantitativ macht.
Die LC8-Familie von Dynein-Lichtketten wurde zuerst als Untereinheit des Dynein-Motorkomplexes16 beschrieben und als Frachtadapter vermutet. Seit seiner ersten Entdeckung wurde LC8 in mehreren Proteinkomplexen neben dem Dynein-Motorkomplex17,,18,,19,20gefunden. Das Scannen nach Proteinsequenzen, die das LC8-Interaktionsmotiv19 enthalten, legt nahe, dass LC8 viele Wechselwirkungen mit einer Vielzahl verschiedener Proteine haben kann17,18,19,20,21,22. Als Ergebnis gelten Proteine der LC8-Familie heute als Naben, die die Montage größerer Proteinkomplexe19,22, wie Assemblys von intrinsisch ungeordneten Proteinen21, fördern.
Ein C. elegans LC8-Familie Protein, Dynein light chain-1 (DLC-1), ist weit verbreitet über viele Gewebe und nicht in spezifischen subzellulären Strukturen angereichert23,24. Folglich ist die Identifizierung biologisch relevanter In-vivo-Partner von DLC-1 in C. elegans aus einer Reihe von Gründen eine Herausforderung: 1) Die Co-Immunpräzipation gibt nicht die Gewebequelle an, in der die Wechselwirkung auftritt; 2) eine begrenzte Expression bestimmter Partner oder vorübergehende Wechselwirkungen kann die Fähigkeit behindern, eine Wechselwirkung durch Ko-Immunpräzipation zu erkennen; und 3) die diffuse Verteilung von DLC-1 führt zu unspezifischen Überschneidungen mit potenziellen Partnerproteinen durch Co-Immunostaining. Basierend auf diesen Herausforderungen ist PLA ein idealer Ansatz, um In-vivo-Interaktionen mit DLC-1 zu testen.
Es wurde bereits berichtet, dass DLC-1 direkt mit den RNA-bindenden Proteinen (RBPs) FBF-223 und GLD-125interagiert und als Cofaktor dient. Unsere Arbeit unterstützt das Modell von DLC-1, das als Nabenprotein dient, und schlägt vor, dass DLC-1 ein Interaktionsnetzwerk ermöglicht, das sich über Dynein19,22hinaus erstreckt. Mit einem GST-Pulldown-Assay wurde ein neuer DLC-1-interagierender RBP namens OMA-1 identifiziert26. OMA-1 ist wichtig für Eizellenwachstum und meiotische Reifung27 und funktioniert in Verbindung mit einer Reihe von translationalen Repressoren und Aktivatoren28. Während FBF-2 und GLD-1 in den Stammzellen bzw. meioten Pachytenregionen exprimiert werden, wird OMA-1 in der Keimbahn aus dem meiotischen Pachyten durch die Eizellen27 diffus exprimiert (Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass DLC-1 komplexe Komplexe mit RBPs in verschiedenen Regionen des Gonaden bildet. Es wurde auch festgestellt, dass die direkte Interaktion zwischen DLC-1 und OMA-1, die in vitro beobachtet wurde, nicht durch ein In-vivo-IP wiederhergestellt wird. Die PLA wurde erfolgreich als alternativer Ansatz verwendet, um diese Wechselwirkung in der C. elegans Keimbahn weiter zu untersuchen, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PLA verwendet werden kann, um viele andere PPI im Wurm zu untersuchen.
Bei der Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn ermöglicht die höhere Auflösung, die PLA im Vergleich zur Co-Immunostainierung bietet, die Visualisierung und Quantifizierung von Orten, an denen Wechselwirkungen in der Keimbahn auftreten. Es wurde zuvor berichtet, dass DLC-1 direkt mit OMA-1 interagiert, indem ein in vitro GST Pulldown-Assay26verwendet wird; Diese Wechselwirkung wurde jedoch nicht durch einen In-vivo-Pulldown wiederhergestellt. Die fluoreszierende Co-Im…
The authors have nothing to disclose.
Einige Nematodenstämme, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Caenorhabditis Genetics Center bereitgestellt, das von der NIH (P40OD010440) finanziert wurde. Die konfokale Mikroskopie wurde im BioSpectroscopy Core Research Laboratory der University of Montana durchgeführt, das mit Unterstützung der NIH Awards P20GM103546 und S10OD021806 betrieben wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch das NIH-Stipendium GM109053 an E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 an X.W. und Montana Academy of Sciences Award an X.W. unterstützt. Die Geldgeber waren weder an der Studiengestaltung noch am Verfassen des Berichts beteiligt. Wir danken Herrn Ellenbecker für die Diskussion.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |