Denne protokollen demonstrerer bruk av nærhetligation analyse for å sonde for protein-protein interaksjoner in situ i C. elegans germline.
Å forstå når og hvor proteinproteininteraksjoner (PPIer) oppstår er avgjørende for å forstå proteinfunksjon i cellen og hvordan bredere prosesser som utvikling påvirkes. Caenorhabditis elegans germline er et flott modellsystem for å studere PPIer som er relatert til regulering av stamceller, meiose og utvikling. Det finnes en rekke velutviklede teknikker som gjør at proteiner av interesse kan merkes for anerkjennelse av standard antistoffer, noe som gjør dette systemet fordelaktig for nærhetligation analyse (PLA) reaksjoner. Som et resultat er PLA i stand til å vise hvor PPIer forekommer på en romlig og temporal måte i bakterier mer effektivt enn alternative tilnærminger. Beskrevet her er en protokoll for anvendelse og kvantifisering av denne teknologien for å sondere PPIer i C. elegans germline.
Over 80% av proteiner er anslått å ha interaksjoner med andre molekyler1, noe som understreker hvor viktig PPI er for utførelsen av spesifikke biologiske funksjoner i celle2. Noen proteiner fungerer som huber som letter montering av større komplekser som er nødvendige for celleoverlevelse1. Disse hubene medierer flere PPI-er og bidrar til å organisere proteiner i et nettverk som letter bestemte funksjoner i en celle3. Dannelse av proteinkomplekser påvirkes også av biologisk kontekst, for eksempel tilstedeværelse eller fravær av spesifikke interagerende partnere4,cellesignalhendelser og utviklingsstadium av en celle.
C. elegans brukes ofte som modellorganisme for en rekke studier, inkludert utvikling. Den enkle anatomien til dette dyret består av flere organer, inkludert gonad, tarm og gjennomsiktig skjellaget, noe som letter analysen av ormutvikling. Germline bosatt i gonad er et flott verktøy for å studere hvordan germline stamceller modnes til gametes5 som utvikler seg til embryoer og til slutt neste generasjon av avkom. Den distale spissen i germline inneholder et utvalg av selvfornyende stamceller (Figur 1). Som stamceller forlate nisje, de utvikler seg inn i meiotic pachytene og til slutt utvikle seg til oocytes i den unge voksne scenen (Figur 1). Dette utviklingsprogrammet i germline er tett regulert gjennom ulike mekanismer, inkludert et post-transkripsjonsbasert regulatorisk nettverk tilrettelagt av RNA-bindende proteiner (RbPs)6. PPI er viktig for denne regulatoriske aktiviteten, da RBPs forbinder med andre faktorer for å utøve sine funksjoner.
Det er flere tilnærminger som kan brukes til å sonde for PPI er i ormen, men hver har unike begrensninger. In vivo immunoprecipitation (IP) kan brukes til å isolere protein-protein komplekser fra hele orm ekstrakter; Denne tilnærmingen angir imidlertid ikke hvor PPI forekommer i ormen. I tillegg kan proteinkomplekser som er forbigående og bare dannes under et bestemt utviklingsstadium eller i et begrenset antall celler, være vanskelig å gjenopprette ved ko-immunnedbør. Til slutt må IP-eksperimenter ta opp bekymringene til proteinkompleks resortiment etter lysis og ikke-spesifikk oppbevaring av proteiner på affinitetsmatrisen.
Alternative tilnærminger for in situ påvisning av PPI er co-immunostaining, Förster resonans energioverføring (FRET), og bimolekylær fluorescens komplementering (BiFC). Ko-immunostaining er avhengig av samtidig påvisning av to proteiner av interesse i fast ormvev og måling av omfanget av signalkolokalisering. Bruk av superoppløsningsmikroskopi, som gir større detaljer enn standard mikroskopi7,bidrar til å strengere teste proteinkolokalisering utover diffraksjonsbegrenset barriere på 200-300 nm8. Co-immunostaining ved hjelp av både konvensjonell og superoppløsningsmikroskopi fungerer imidlertid best for proteiner med veldefinerte lokaliseringsmønstre. Derimot blir det mye mindre informativt for diffust distribuerte samhandlende partnere. Måling for samlokalisering av signaler basert på overlapping gir ikke nøyaktig informasjon om proteinene er i kompleks med hverandre9,10.
Videre er co-immunnedbør og co-immunostaining av protein-protein komplekser ikke kvantitative, noe som gjør det utfordrende å avgjøre om slike interaksjoner er betydelige. FRET og BiFC er begge fluorescerende teknikker. FRET er avhengig av merking av proteiner av interesse med fluorescerende proteiner (FPs) som har spektral overlapping der energi fra en FP (donor) overføres til en annen FP (acceptor)11. Denne ikke-bestrålte overføringen av energi resulterer i fluorescens av acceptor FP som kan oppdages ved sin respektive bølgelengde av utslipp. BiFC er basert på rekonstituering av et fluorescerende protein in vivo. Det innebærer å dele GFP i to komplementære fragmenter, som helices 1-10 og helix 1112, som deretter smeltes sammen til to proteiner av interesse. Hvis disse to proteinene samhandler, blir de komplementære fragmentene av GFP nær nok i nærheten av å brette og montere, rekonstituere GFP-fluorofanen. Rekonstituert GFP observeres deretter direkte som fluorescens og indikerer hvor en PPI har oppstått.
Som sådan er både FRET og BiFC avhengige av store fluorescerende koder som kan forstyrre funksjonen til det kodede proteinet. I tillegg krever FRET og BiFC rikelig og sammenlignbart uttrykk for de kodede proteinene for å oppnå nøyaktige data. FRET er kanskje ikke egnet for eksperimenter der en partner er i overkant av den andre, noe som kan føre til høy bakgrunn13. Overuttrykk i BiFC eksperimenter bør også unngås, da dette kan indusere uspesifikk montering14 som resulterer i økt bakgrunn. Begge teknikkene krever optimalisering av uttrykk og bildebehandlingsforhold for de merkede proteinene, noe som kan forlenge tiden som kreves for å fullføre eksperimenter.
Nærhetsanalysen (PLA) er en alternativ tilnærming som kan adressere begrensningene i teknikkene nevnt ovenfor. PLA utnytter primære antistoffer som gjenkjenner proteiner av interesse (eller deres koder). Disse primære antistoffene er deretter bundet av sekundære antistoffer som inneholder oligonucleotide prober som kan hybridisere med hverandre når innenfor en 40 nm (eller kortere) avstand15. Det resulterende hybridiserte DNA forsterkes gjennom en PCR-reaksjon, som oppdages av sonder som utfyller DNA. Dette resulterer i foci som visualiseres av et mikroskop. Denne teknologien kan oppdage PPI-er in situ i komplekse vev (dvs. ormen gonad), som er organisert som en samlebånd som inneholder celler på ulike stadier av utvikling og differensiering. Med PLA kan PPI-er visualiseres direkte i en fast ormgonad, noe som er en fordel for å undersøke om PPI-er forekommer under et bestemt utviklingsstadium. PLA tilbyr større oppløsning av PPI-er i motsetning til co-lokalisering-baserte analyser, som er ideell for å gjøre nøyaktige målinger. Hvis den brukes, har mikroskopi med superoppløsning potensial til å gi finere detaljer om plasseringen av PLA-foci i en celle. En annen fordel er at foci som følge av PLA reaksjoner kan telles av en ImageJ-basert analyse arbeidsflyt, noe som gjør denne teknikken kvantitativ.
LC8-familien av dyneinlyskjeder ble først beskrevet som en underenhet av dyneinmotorkomplekset16 og hypotetisk for å fungere som en lastadapter. Siden den første oppdagelsen har LC8 blitt funnet i flere proteinkomplekser i tillegg til dyneinmotorkomplekset17,18,19,20. Skanning etter proteinsekvenser som inneholder LC8 interaksjonsmotivet19 antyder at LC8 kan ha mange interaksjoner med et bredt spekter av forskjellige proteiner17,,18,,19,,20,21,22. Som et resultat anses LC8-familieproteiner nå som knutepunkter som bidrar til å fremme montering av større proteinkomplekser19,22, for eksempel samlinger av iboende uordenproteiner21.
En C. elegans LC8-familie protein, dynein lyskjede-1 (DLC-1), er mye uttrykt over mange vev og ikke beriket i spesifikke subcellulære strukturer23,24. Følgelig er identifisering av biologisk relevante in vivo partnere av DLC-1 i C. elegans utfordrende av en rekke grunner: 1) co-immunoprecipitation indikerer ikke vevskilden der interaksjonen oppstår; 2) begrenset uttrykk for bestemte partnere eller forbigående interaksjoner kan hindre evnen til å oppdage en interaksjon ved co-immunnedbør; og 3) diffus fordeling av DLC-1 fører til ikke-spesifikk overlapping med potensielle partnerproteiner ved ko-immunfarging. Basert på disse utfordringene er PLA en ideell tilnærming for testing av vivo-interaksjoner med DLC-1.
Det har tidligere blitt rapportert at DLC-1 samhandler direkte med og fungerer som en kofaktor for RNA-bindende proteiner (RBPs) FBF-223 og GLD-125. Vårt arbeid støtter modellen av DLC-1 som fungerer som et hubprotein og antyder at DLC-1 letter et interaksjonsnettverk som strekker seg utover dynein19,22. Ved hjelp av en GST pulldown analyse, en ny DLC-1-samhandlende RBP kalt OMA-1 har blitt identifisert26. OMA-1 er viktig for oocyte vekst og meiotisk modning27 og funksjoner i forbindelse med en rekke translasjonelle undertrykkere og aktivatorer28. Mens FBF-2 og GLD-1 uttrykkes i stamceller og meiotiske pachytene-regioner, er OMA-1 diffust uttrykt i kimlinjen fra den meiotiske pachytene gjennom oocytes27 (Figur 1). Dette tyder på at DLC-1 danner komplekser med RBPs i forskjellige regioner av gonad. Det har også blitt funnet at den direkte interaksjonen mellom DLC-1 og OMA-1 observert in vitro ikke gjenopprettes av en in vivo IP. PLA har blitt brukt som en alternativ tilnærming til videre studier av denne interaksjonen i C. elegans germline, og resultatene tyder på at PLA kan brukes til å sondere mange andre PPIer i ormen.
Ved studier av PPI-er i C. elegans-germline, gir den høyere oppløsningen som tilbys av PLA sammenlignet med ko-immunfarging visualisering og kvantifisering av steder der interaksjoner forekommer i kimlinjen. Det ble tidligere rapportert at DLC-1 direkte samhandler med OMA-1 ved hjelp av en in vitro GST pulldown analyse26; Denne interaksjonen ble imidlertid ikke gjenopprettet av en in vivo pulldown. Fluorescerende ko-immunostaining av 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP-germlines viser e…
The authors have nothing to disclose.
Noen nematode stammer som brukes i denne studien ble levert av Caenorhabditis Genetics Center finansiert av NIH (P40OD010440). Confocal mikroskopi ble utført i University of Montana BioSpectroscopy Core Research Laboratory operert med støtte fra NIH Awards P20GM103546 og S10OD021806. Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-stipendet GM109053 til E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 til X.W., og Montana Academy of Sciences award til X.W. Funders var ikke involvert i studiedesign eller skriving av rapporten. Vi takker M. Ellenbecker for diskusjon.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |