Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.
Comprender cuándo y dónde se producen las interacciones proteína-proteína (IPP) es fundamental para comprender la función proteica en la célula y cómo se ven afectados procesos más amplios como el desarrollo. La línea germinal Caenorhabditis elegans es un gran sistema modelo para estudiar los IBP relacionados con la regulación de las células madre, la meiosis y el desarrollo. Existen una variedad de técnicas bien desarrolladas que permiten etiquetar proteínas de interés para su reconocimiento por anticuerpos estándar, lo que hace que este sistema sea ventajoso para las reacciones de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Como resultado, el PLA es capaz de mostrar dónde los IBP se producen de manera espacial y temporal en líneas germinales de manera más eficaz que los enfoques alternativos. Aquí se describe un protocolo para la aplicación y cuantificación de esta tecnología para sondear los IBP en la línea germinal c. elegans.
Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular1. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la presencia o ausencia de socios interactuadores específicos4,eventos de señalización celular y la etapa de desarrollo de una célula.
C. elegans se utiliza comúnmente como un organismo modelo para una variedad de estudios, incluyendo el desarrollo. La simple anatomía de este animal se compone de varios órganos, incluyendo la gónada, el intestino y la cutícula transparente, que facilita el análisis del desarrollo del gusano. La germlina que reside en la gónada es una gran herramienta para estudiar cómo las células madre germinales maduran en gametos5 que se convierten en embriones y, finalmente, en la próxima generación de progenie. La región de la punta distal de la línea germinal contiene un grupo de células madre autonuevas(Figura 1). A medida que las células madre salen del nicho, progresan hacia el paquiteno meiótico y finalmente se convierten en ovocitos en la etapa adulta joven(Figura 1). Este programa de desarrollo en la línea germinal está estrechamente regulado a través de diferentes mecanismos, incluyendo una red reguladora post-transcripción facilitada por proteínas de unión al ARN (RBP)6. Los IBP son importantes para esta actividad regulatoria, ya que los PBP se asocian con otros cofactores para ejercer sus funciones.
Hay varios enfoques que se pueden utilizar para sondear los IBP en el gusano, pero cada uno tiene limitaciones únicas. La inmunoprecipitación in vivo (IP) se puede utilizar para aislar complejos de proteínas y proteínas de extractos de gusanos enteros; sin embargo, este enfoque no indica dónde se produce el IBP en el gusano. Además, los complejos proteicos que son transitorios y sólo se forman durante una etapa específica de desarrollo o en un número limitado de células pueden ser difíciles de recuperar por co-inmunoprecipitación. Por último, los experimentos de IP deben abordar las preocupaciones del reordenamiento complejo de proteínas después de la lisis y la retención no específica de proteínas en la matriz de afinidad.
Los enfoques alternativos para la detección in situ de IBP son la co-inmunoingestión, la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) y la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC). La inmunoinserción se basa en la detección simultánea de dos proteínas de interés en el tejido de gusano fijo y la medición del alcance de la colocalización de la señal. El uso de la microscopía de superresolución, que ofrece un mayor detalle que la microscopía estándar7,ayuda a probar más rigurosamente la colocalización de proteínas más allá de la barrera limitada por difracción de 200-300 nm8. Sin embargo, la co-inmunomancha utilizando micromicroscopía convencional y de superresolución funciona mejor para proteínas con patrones de localización bien definidos. Por el contrario, se vuelve mucho menos informativo para los socios que interactúan distribuidas difusamente. La medición para la colocalización de señales basadas en la superposición no proporciona información precisa sobre si las proteínas están en complejo entre sí9,10.
Además, la co-inmunoprecipitación y la co-inmuno-inmunoinactividad de los complejos proteína-proteína no son cuantitativas, por lo que es difícil determinar si tales interacciones son significativas. FRET y BiFC son técnicas fluorescentes. FRET se basa en el etiquetado de proteínas de interés con proteínas fluorescentes (FP) que tienen superposición espectral en la que la energía de un FP (donante) se transfiere a otro FP (aceptador)11. Esta transferencia no radiativa de energía da lugar a la fluorescencia del FP aceptador que se puede detectar en su respectiva longitud de onda de emisión. BiFC se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente in vivo. Implica dividir GFP en dos fragmentos complementarios, como hélices 1-10 y hélice 1112,que luego se fusionan en dos proteínas de interés. Si estas dos proteínas interactúan, los fragmentos complementarios de GFP se vuelven lo suficientemente cercanos como para plegarse y ensamblarse, reconstituyendo el fluoróforo de GFP. La GFP reconstituida se observa directamente como fluorescencia e indica dónde se ha producido un IBP.
Como tal, tanto FRET como BiFC dependen de grandes etiquetas fluorescentes que pueden alterar la función de la proteína etiquetada. Además, FRET y BiFC requieren una expresión abundante y comparable de las proteínas etiquetadas para obtener datos precisos. FRET puede no ser adecuado para experimentos en los que un socio es superior al otro, lo que puede conducir a un fondo alto13. También se debe evitar la sobreexpresión en experimentos DeFC, ya que esto puede inducir un ensamblado no específico14 que da lugar a un mayor fondo. Ambas técnicas requieren la optimización de las condiciones de expresión e imagen de las proteínas etiquetadas, lo que puede prolongar el tiempo necesario para completar los experimentos.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es un enfoque alternativo que puede abordar las limitaciones de las técnicas mencionadas anteriormente. PLA aprovecha los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas de interés (o sus etiquetas). Estos anticuerpos primarios están enlazados por anticuerpos secundarios que contienen sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarentrelazados entre sí cuando están dentro de una distancia de 40 nm (o más corta)15. El ADN hibridado resultante se amplifica a través de una reacción PCR, que es detectada por sondas que complementan el ADN. Esto da como resultado focos que son visualizados por un microscopio. Esta tecnología puede detectar IBP in situ en tejidos complejos (es decir, la gónada de gusano), que se organiza como una línea de ensamblaje que contiene células en varias etapas de desarrollo y diferenciación. Con PLA, los IBP se pueden visualizar directamente en una gónada de gusano fija, lo que es ventajoso para investigar si los IBP se producen durante una etapa específica de desarrollo. PLA ofrece una mayor resolución de los IBP en comparación con los ensayos basados en la colocalización, que es ideal para realizar mediciones precisas. Si se utiliza, la microscopía de superresolución tiene el potencial de proporcionar detalles más finos sobre la ubicación de los focos de PLA dentro de una célula. Otra ventaja es que los focos resultantes de las reacciones PLA pueden ser contados por un flujo de trabajo de análisis basado en ImageJ, haciendo que esta técnica sea cuantitativa.
La familia LC8 de cadenas ligeras de dynein fue descrita por primera vez como una subunidad del complejo de motores de dinin16 e hipotetizado para servir como adaptador de carga. Desde su descubrimiento inicial, LC8 se ha encontrado en múltiples complejos proteicos además del complejo motor de dinina17,,18,,19,,20. El escaneo de secuencias de proteínas que contienen el motivo de interacción LC819 sugiere que LC8 puede tener muchas interacciones con una amplia gama de diferentes proteínas17,,18,19,20,21,22. Como resultado, las proteínas de la familia LC8 ahora se consideran centros que ayudan a promover el ensamblaje de complejos proteicos más grandes19,,22, como ensamblajes de proteínas intrínsecamente desordenadas21.
Una proteína de la familia C. elegans LC8, cadena de luz de dinneina-1 (DLC-1), se expresa ampliamente en muchos tejidos y no se enriquece en estructuras subcelulares específicas23,24. En consecuencia, la identificación de socios in vivo biológicamente relevantes de DLC-1 en C. elegans es difícil por varias razones: 1) la coinmunoprecipitación no indica la fuente de tejido donde se produce la interacción; 2) la expresión limitada de socios particulares o las interacciones transitorias pueden obstaculizar la capacidad de detectar una interacción por coinmunoprecipitación; y 3) la distribución difusa de DLC-1 conduce a una superposición no específica con las proteínas potenciales asociadas mediante la inmunoingestión. Basado en estos desafíos, PLA es un enfoque ideal para probar interacciones in vivo con DLC-1.
Se ha informado previamente que DLC-1 interactúa directamente con y sirve como cofactor para las proteínas de unión al ARN (RBP) FBF-223 y GLD-125. Nuestro trabajo apoya el modelo de DLC-1 sirviendo como proteína de cubo y sugiere que DLC-1 facilita una red de interacción que abarca más allá de la dinin19,,22. Usando un ensayo desplegable GST, se ha identificado un nuevo RBP de interacción con DLC-1 denominado OMA-126. OMA-1 es importante para el crecimiento de ovocitos y la maduración meiótica27 y funciona en conjunto con una serie de represores y activadores traslacionales28. Mientras que FBF-2 y GLD-1 se expresan en las células madre y las regiones meioticas de paquiteno, respectivamente, OMA-1 se expresa difusamente en la línea germinal del paquiteno meiotico a través de los ovocitos27 (Figura 1). Esto sugiere que el DLC-1 forma los complejos con los RBP en las diversas regiones de la gónada. También se ha encontrado que la interacción directa entre DLC-1 y OMA-1 observada in vitro no se recupera mediante una IP in vivo. El PLA se ha utilizado con éxito como un enfoque alternativo para estudiar más a fondo esta interacción en la línea germinal de C. elegans, y los resultados sugieren que el PLA se puede utilizar para sondear muchos otros IBP en el gusano.
Cuando se estudian los IBP en la línea germinal de C. elegans, la mayor resolución ofrecida por el ELA en comparación con la inmunoinserización permite la visualización y cuantificación de lugares donde se producen interacciones en la línea germinal. Anteriormente se informó que el DLC-1 interactúa directamente con OMA-1 utilizando un ensayo desplegable in vitro del GST26; sin embargo, esta interacción no fue recuperada por un pulldown in vivo. La co-inmunoinseración f…
The authors have nothing to disclose.
Algunas cepas de nematodos utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis financiado por el NIH (P40OD010440). La microscopía confocal se realizó en el Laboratorio de Investigación Core de la Universidad de Montana BioSpectroscopy operado con el apoyo de los NIH Awards P20GM103546 y S10OD021806. Este trabajo fue apoyado en parte por la concesión de NIH GM109053 a E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., y montana Academy of Sciences award a X.W. Los funders no participaron en el diseño del estudio ni en la redacción del informe. Agradecemos a M. Ellenbecker por su discusión.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |