Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.
Protein-protein etkileşimlerinin (PPI) ne zaman ve nerede oluştuğunu anlamak, hücredeki protein işlevini ve gelişim gibi daha geniş süreçlerin ne kadar etkilendiğini anlamak için çok önemlidir. Caenorhabditis elegans germline kök hücrelerin düzenlenmesi ile ilgili PPIs eğitimi için harika bir model sistemidir, kekozis, ve gelişme. İlgi proteinlerin standart antikorlar tarafından tanınmak üzere etiketlenmelerine olanak tanıyan çeşitli iyi geliştirilmiş teknikler vardır, bu da bu sistemi yakınlık ligasyon testisi (PLA) reaksiyonları için avantajlı hale getirir. Sonuç olarak PLA, ppi’lerin germlines’de mekansal ve zamansal bir şekilde nerede oluştuğunu alternatif yaklaşımlardan daha etkili bir şekilde gösterebiliyor. Burada açıklanan uygulama ve c. elegans germline ppis araştırmak için bu teknolojinin niceliklendirme için bir protokoldür.
Proteinlerin %80’inden fazlasının diğer moleküllerle etkileşimleri olduğu tahmin edilmektedir1, bu da PPI’ların hücre2’dekibelirli biyolojik fonksiyonların yürütülmesinde ne kadar önemli olduğunu vurgular. Bazı proteinler hücre sağkalım için gerekli olan büyük komplekslerin montajını kolaylaştıran hub’lar olarak işlevgörürler 1. Bu hub’lar birden çok PPI’ya aracılık eder ve proteinlerin hücre3’tekibelirli işlevleri kolaylaştıran bir ağ halinde organize etmeye yardımcı olur. Protein komplekslerinin oluşumu da biyolojik bağlam etkilenir, belirli etkileşimli ortakların varlığı veya yokluğu gibi4,hücre sinyal olayları, ve bir hücrenin gelişim evresi.
C. elegans yaygın geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır. Bu hayvanın basit anatomisi, solucan gelişiminin analizini kolaylaştıran gonad, bağırsak ve şeffaf mitikül de dahil olmak üzere çeşitli organlardan oluşur. Gonad’da yaşayan germin, germline kök hücrelerinin embriyolara ve sonunda yeni nesil singenlere dönüşengametler 5’e nasıl olgunlaştığını incelemek için harika bir araçtır. Germline distal uç bölgesi kendi kendini yenileyen kök hücrelerden oluşan bir havuz içerir(Şekil 1). Kök hücreler niş bırakın gibi, onlar meiyotik pachytene içine ilerleme ve sonunda genç yetişkin aşamasında yumurta içine gelişir (Şekil 1). Germline geliştirme Bu program sıkı rna bağlayıcı proteinler (RRB)6tarafından kolaylaştırılen bir post-transkripsiyonel düzenleyici ağ da dahil olmak üzere farklı mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. PpI’lar bu düzenleyici etkinlik için önemlidir, çünkü KP’ler işlevlerini yerine getirmek için diğer kofaktörlerle ilişkilendirilir.
Solucanda PPI’lar için sondalamak için kullanılabilecek çeşitli yaklaşımlar vardır, ancak her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. In vivo immünopresipite (IP) protein-protein komplekslerini tüm solucan özlerinden ayırmak için kullanılabilir; ancak bu yaklaşım, ÜFE’nin solucanda nerede oluştuğunu göstermez. Buna ek olarak, geçici ve sadece gelişim belirli bir aşamada veya sınırlı sayıda hücre de form protein kompleksleri co-immünopresid ile kurtarmak zor olabilir. Son olarak, IP deneyleri lysis ve afinite matris proteinlerin non-spesifik tutma sonra protein kompleksi reassortment endişeleri ele almak gerekir.
PPI yerinde tespiti için alternatif yaklaşımlar ko-immünboyama, Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan kompleman (BiFC) vardır. Ko-immünboyama sabit solucan dokusunda ilgi iki protein eşzamanlı algılama ve sinyal kolokalizasyonu ölçüde ölçümü dayanır. Standart mikroskopi7daha fazla ayrıntı sunan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, 200-300 nm8kırınım sınırlı bariyer ötesinde protein kolokalizasyonu daha sıkı test etmek için yardımcı olur. Ancak, hem konvansiyonel hem de süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak ko-immünboyama iyi tanımlanmış lokalizasyon desenleri olan proteinler için en iyi çalışır. Buna karşılık, yaygın olarak dağıtılan etkileşimli ortaklar için çok daha az bilgilendirici hale gelir. Örtüşmeye dayalı sinyallerin birlikte lokalizasyonu için ölçüm proteinlerin birbiriyle karmaşık olup olmadığı hakkında doğru bilgi sağlamaz9,10.
Ayrıca, protein-protein komplekslerinin ko-immünopresipitasyon ve ko-immünboyboyama kantitatif değildir, bu tür etkileşimlerin önemli olup olmadığını belirlemek zor hale. FRET ve BiFC floresan tabanlı tekniklerdir. FRET floresan proteinler ile ilgi proteinleri etiketleme dayanır (FPs) hangi bir FP enerji transfer spektral örtüşme var (donör) başka bir FP (alıcı)11aktarılır. Enerjinin bu radyatif olmayan transferi, kendi dalga boyunda tespit edilebilen alıcı FP’nin floresanlığına neden olur. BiFC in vivofloresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. GFP’nin helikes 1-10 ve helix 1112gibi iki tamamlayıcı parçaya bölünmesini gerektirir ve bu parçalar daha sonra iki proteinle kaynaşır. Eğer bu iki protein etkileşirse, GFP’nin tamamlayıcı parçaları katlamak ve biraraya gelmek için yeterince yakınlaşır ve GFP floroforu yeniden kurar. Yeniden oluşturulan GFP daha sonra doğrudan floresan olarak gözlenir ve üfe’nin nerede oluştuğunu gösterir.
Bu nedenle, hem FRET hem de BiFC, etiketlenen proteinin işlevini bozabilecek büyük floresan etiketlere bağlıdır. Buna ek olarak, FRET ve BiFC doğru veri elde etmek için etiketli proteinlerin bol ve karşılaştırılabilir ifade gerektirir. FRET, bir ortağın diğerini aşan olduğu ve yüksek arka plan13’eyol açabilen deneyler için uygun olmayabilir. BiFC denemelerinde aşırı ifadeden de kaçınılmalıdır, çünkü bu, daha yüksek arka planla sonuçlanan nonspesifik derleme14’ü tetikleyebilir. Her iki teknik de, etiketli proteinlerin ekspresyonu ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir, bu da deneyleri tamamlamak için gereken süreyi uzatabilir.
Yakınlık ligasyon tsurju (PLA) yukarıda bahsedilen tekniklerin sınırlamalarını ele alabilecek alternatif bir yaklaşımdır. PLA, ilgi çeken proteinleri (veya etiketlerini) tanıyan birincil antikorlardan yararlanır. Bu primer antikorlar daha sonra 40 nm (veya daha kısa) mesafe15içinde birbirleriyle melezleşebilir oligonükleotid probları içeren ikincil antikorlar ile bağlanır. Ortaya çıkan melezdna, DNA’yı tamamlayan problar tarafından algılanan bir PCR reaksiyonu ile güçlenir. Bu bir mikroskop tarafından görselleştirilmiş foci sonuçlanır. Bu teknoloji, gelişim ve farklılaşmanın çeşitli aşamalarında hücreleri içeren bir montaj hattı olarak organize edilen karmaşık dokularda (yani solucan gonad) yerinde PPI’ları algılayabilir. PLA ile PPI’lar sabit solucan gonad’da doğrudan görselleştirilebilir, bu da PPI’ların gelişimin belirli bir aşamasında oluşup oluşmadığını araştırmak için avantajlıdır. PLA, kesin ölçümler yapmak için ideal olan eş-lokalizasyon tabanlı tahliller yerine PPI’lerin daha fazla çözünürlüğü sunar. Kullanılırsa, süper çözünürlüklü mikroskopi bir hücre içinde PLA foci konumu hakkında ince ayrıntı sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir avantajı pla reaksiyonları kaynaklanan foci bir ImageJ tabanlı analiz iş akışı ile sayılır olabilir, bu tekniği nicel hale.
Dynein Hafif Zincirleri LC8 ailesi ilk dynein motor kompleksi16 bir alt birim olarak tanımlanan ve bir kargo adaptörü olarak hizmet hipotezi. İlk keşfinden bu yana, LC8 dynein motor kompleksi ek olarak birden fazla protein kompleksleri bulunmuştur17,18,19,20. LC8 etkileşim motifi içeren protein dizileri için tarama19 LC8 farklı proteinlerin geniş bir dizi ile birçok etkileşimleri olabileceğini düşündürmektedir17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, LC8 aile proteinleri şimdi daha büyük protein kompleksleri montaj teşvik yardımcı hub olarak kabul edilir19,22, özünde düzensiz proteinlerin meclisleri gibi21.
Bir C. elegans LC8-aile protein, dynein ışık zinciri-1 (DLC-1), yaygın birçok dokular arasında ifade edilir ve belirli hücre altı yapılarda zenginleştirilmiş değil23,24. Sonuç olarak, C. elegans DLC-1 biyolojik olarak ilgili in vivo ortaklarının belirlenmesi çeşitli nedenlerle zor: 1) co-immünoprepitasyon etkileşimoluşur doku kaynağı göstermez; 2) belirli ortakların sınırlı ekspresyonu veya geçici etkileşimleri co-immünoprepitasyon ile bir etkileşimi tespit etme yeteneğini engelleyebilir; ve 3) DLC-1 diffüz dağılımı co-immünboyama tarafından potansiyel ortak proteinler ile non-spesifik örtüşme yol açar. Bu zorluklara dayanarak PLA, DLC-1 ile in vivo etkileşimlerini test etmek için ideal bir yaklaşımdır.
Daha önce DLC-1 ile doğrudan etkileşim ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB) FBF-223 ve GLD-1 25 için bir kofaktör olarak hizmetbildirilmiştir. Çalışmalarımız dlc-1 bir hub protein olarak hizmet modeli destekler ve DLC-1 dynein ötesinde kapsayan bir etkileşim ağı kolaylaştırır düşündürmektedir19,22. GST pulldown tetkik kullanarak, OMA-1 adlı yeni bir DLC-1-etkileşen RBP26tespit edilmiştir. OMA-1 yumurta büyümesi ve meiyotik olgunlaşma27 için önemlidir ve bir dizi çevirisel baskılayıcı ve aktivatörlerle birlikte işlevler28. FBF-2 ve GLD-1 sırasıyla kök hücreler ve meyolitik pakiten bölgelerinde ifade edilirken, OMA-1 oositler27 ile meiyotik pachytenden mikropta yaygın olarak ifade edilir (Şekil 1). Bu, DLC-1 gonad farklı bölgelerde RbPs ile kompleksleri oluşturur düşündürmektedir. Ayrıca in vitro gözlenen DLC-1 ve OMA-1 arasındaki doğrudan etkileşim in vivo IP ile kurtarılamadı bulunmuştur. PLA başarıyla C. elegans germline bu etkileşimi daha fazla çalışma için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmıştır, ve sonuçlar PLA solucan diğer birçok PPIs araştırmak için kullanılabilir öneririz.
C. elegans germline PPIs çalışırken, ko-immünboyama ile karşılaştırıldığında PLA tarafından sunulan yüksek çözünürlük görselleştirme ve etkileşimleri germline meydana yerlerin nicel sağlar. Daha önce DLC-1’in IN vitro GST pulldown tetkik26kullanarak OMA-1 ile doğrudan etkileşime girdiği bildirilmiştir; ancak, bu etkileşim bir in vivo pulldown tarafından kurtarılamadı. Floresan ko-immünboyboya 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines DLC-1 ve OMA-1 iç…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada kullanılan bazı nematod suşları NIH (P40OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Nih Ödülleri P20GM103546 ve S10OD021806’nın desteğiyle işletilen Montana BiyoSpektroskopi Çekirdek Araştırma Laboratuvarı’nda konfokal mikroskopi yapıldı. Bu çalışma kısmen NIH’nin GM109053’ü E.V.’ye, American Heart Association Fellowship 18PRE34070028’i X.W.’ye ve Montana Academy of Sciences ödülü ile X.W.’ye desteklenmiştir. Fon çalışmaları tasarımı veya rapor yazma dahil değildi. Tartışma için M. Ellenbecker’a teşekkür ederiz.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |