루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

Melanie Key; Amy Bergmann; Chiara Micchelli; L. Brock Thornton; Sophie Millard; Zhicheng Dou

doi:10.3791/60985

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방법 논문

루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 세포내 톡소플라즈마 곤디성장에 대한 화학적 억제제 효율 결정

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DOI:

10.3791/60985

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2020년 4월 29일

Melanie Key^*¹^,² , Amy Bergmann^*¹^,² , Chiara Micchelli¹^,² , L. Brock Thornton¹^,² , Sophie Millard¹^,² , Zhicheng Dou¹^,²

¹Department of Biological Sciences, Clemson University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서 제시된 프로토콜은 루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 톡소플라즈마 곤디의 시험관내 세포내 성장에 대한 화학화합물의 억제 효능을 평가하는 프로토콜이다. 이 기술은 해당 표적 유전자의 유전적 결실에 의한 억제 특이성을 확인하는 데 사용된다. TgCPL 프로테아제에 대한 LHVS의 억제는 예로 평가된다.

초록

톡소플라즈마 곤디는 인간 인구에 널리 영향을 미치는 원생동물 병원체입니다. 임상 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 현재 항생제는 제한적입니다. 또한, 그들은 사람들의 특정 그룹에 불리 한 부작용을 전시. 따라서 임상 톡소 플라즈마 증에 대한 새로운 치료법의 발견이 필수적입니다. 새로운 항생제 개발의 첫 번째 단계는 높은 처리량 선별 전략을 사용하여 기생충 성장억제에 높은 효능을 보이는 화학 화합물을 식별하는 것입니다. 의무적인 세포내 병원균으로서 Toxoplasma는 숙주 세포 내에서만 복제할 수 있으며, 이는 성장의 빠른 지표로서 광학 흡광도 측정의 사용을 금지합니다. 여기서 제시된 루시퍼라제 기반 성장 분석에 대한 상세한 프로토콜이다. 일례로, 이 방법은 야생형 톡소플라즈마 기생충의 두 배 시간을 계산하고 기생충 세포내 성장억제에 관한 모르폴리누레아-류필-호모페닐-비닐 설폰 페닐(LHVS, 시스테인 프로테아제 표적화합물)의 효능을 측정하는데 사용된다. 또한, 상동성 의존적 재조합(HDR)을 위한 50 bp 상동 영역을 사용하는 톡소플라즈마에서 CRISPR-Cas9 기반 유전자 결실 프로토콜이 기술된다. 야생형 및 TgCPL(톡소플라즈마 카테신 L-like protease)-결핍 기생충에서 LHVS의 억제 효능을 정량화함으로써, LHVS가 Δcpl 성장보다 야생형 기생충 성장을 보다 효율적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 TgCPL이 LHVS가 톡소플라즈마에결합하는 표적임을 시사한다.Toxoplasma 이 루시퍼라제 기반 성장 분석법의 높은 감도와 쉬운 작동은 톡소플라즈마 증식을 모니터링하고 높은 처리량 방식으로 약물 효능을 평가하는 데 적합합니다.

서론

톡소 플라즈마 곤디는 인간 인구의 약 1/3을 감염시키는 매우 성공적인 세포 내 기생충입니다. 그것의 높은 전송 속도는 주로 전염의 그것의 다양 한 경로 에 기인, undercooked 된 고기의 소비를 포함 하 여, 포유류 저수지에 노출, 그리고 출생 시 선천성 전송. T. gondii는 주로 면역 손상된^개별에있는 가혹한 이환율 그리고 사망으로 이끌어 낼 수 있는 기회 감염을 일으키는 원인이 됩니다^1,^2,^,^3,^,^4,^5,^6.^,⁶ 현재 급성 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 항생제는 선천성 및 잠복성 감염 치료에 특히 비효율적이며 일부³^개인3,^7,^,^8에서심각한 반응을 일으킨다. 따라서 새로운 치료법을 식별할 긴급한 필요성이 존재합니다. Toxo....