使用基于路西法抹去的生长测定，确定化学抑制剂对细胞内弓形体贡迪生长的抑制效率

Summary

本文介绍的是一种协议，用于使用基于荧光酶的生长测定来评估化合物对弓形体淋酸体内生长的抑制作用。该技术用于通过基因删除相应的靶基因来确认抑制特异性。以LHVS对TgCPL蛋白酶的抑制为例。

Abstract

弓形虫是一种原生动物病原体，广泛影响人类。目前用于治疗临床弓形虫病的抗生素是有限的。此外，它们在某些人群中表现出不良的副作用。因此，发现临床弓形虫病的新药势在必行。新型抗生素开发的第一步是使用高通量筛选策略识别在抑制寄生虫生长方面表现出高疗效的化合物。作为一种义务细胞内病原体，弓形虫只能在宿主细胞内复制，这禁止使用光学吸收度测量作为生长的快速指标。此处介绍的是基于荧光酶的生长测定的详细协议。例如，该方法用于计算野生型弓形虫寄生虫的倍增时间，并测量莫诺林-利基-同苯-乙烯磺胺苯基（LHVS，一种半胱氨酸蛋白酶靶向化合物）对抑制寄生虫细胞内生长的疗效。还描述了一个基于CRISPR-Cas9的基因删除协议在弓形体使用50bp同源区域进行同源相关重组（HDR）。通过量化LHVS在野生型和TgCPL（弓形体cathein L样蛋白酶）缺乏寄生虫的抑制作用，表明LHVS抑制野生型寄生虫生长比μcpl生长更有效，这表明TgCPL是LHVS结合到弓形虫的目标。这种基于荧光酶的生长测定具有高灵敏度和易于操作，因此适用于监测弓形虫的增殖和以高通量方式评估药物疗效。

Introduction

弓形虫是一种非常成功的细胞内寄生虫，它感染了大约三分之一的人类。其高传播率主要得益于其不同的传播途径，包括食用未煮熟的肉类、接触哺乳动物的水库以及分娩期间的先天性传播。T. Gondii主要导致机会性感染，可导致免疫功能^,低下的个人^{1，2，3，4，5，62,3}的严重发病率和死亡率。^4,5,61目前用于治疗急性弓形虫病的抗生素在治疗先天性和潜伏性感染方面效率特别低^{，在3、7、87,8}引起严重反应。³因此，迫切需要确定新的治疗方法。了解弓形虫及其宿主中亚细胞过程的差异将有助于确定潜在的药物靶点。因此，需要高效和方便的基因组操作技术来研究弓形体中单个基因的作用。此外，弓形虫属于植物性阿皮金，其中包括其他几种重要的人类病原体，如疟原虫和隐孢子虫。因此，弓形虫可以作为模型有机体，以帮助研究其他阿皮质寄生虫的基本生物学。

为了识别针对微生物病原体的新型抗生素，最初对化合物库进行了高通量筛选，以确定其在抑制微生物生长方面的有效性。到目前为止，已经开发出几种基于微孔板的生长测定法，用于测量T的细胞内生长。 贡迪（即放射性³H-uracil基于合并的定量^9，定量ELISA为基础的寄生虫检测使用T.贡迪特异性抗体10，11，记者蛋白质为基础的测量^10,11使用β-加拉西西酶或YFP表达弓形虫菌株^{12，13，,13}和最近开发的高含量成像检测^14）。

这些个别策略都有独特的优势;但是，某些限制也限制了其应用。例如，由于弓形体只能在核动物细胞内复制，因此自荧光和非特异性结合抗T.贡迪抗体对宿主细胞的宿主细胞会导致荧光测量的干扰。此外，使用放射性同位素需要特殊的安全合规性和潜在的安全问题。其中一些测定更适合在单个时间点评估增长，而不是持续监测增长。

此处介绍的是一种基于荧光酶的协议，用于定量细胞内弓形虫生长。在以前的研究中，NanoLuc Luciferase基因在弓形体图布林促进剂下被克隆，这种透明酶表达结构被转染成野生型（RH_ku80+hxg菌株）寄生虫，以产生RH_ku80=hxg：：hxgNLuc菌株（ku80称为RH_ku80：：后NLuc） ^15。ku80在这项研究中，这种菌株作为父母在细胞内生长测定和基因缺失的菌株。使用RH_ku80：：NLuc菌株，在感染后96小时期间监测人类前皮纤维细胞（HFFs）中的寄生虫生长，以计算寄生虫加倍的时间。

此外，通过绘制弓形虫酸的增长率以确定IC₅₀值，可以确定LHVS对寄生虫生长的抑制作用。此前有文献记载，TgCPL是寄生虫中LHVS的主要目标，使用LHVS治疗可减少急性和慢性^,17,18,19弓形虫^{感染的发展}。此外，RH_ku80：：NLuc用作用于基因组修饰的父母菌株，以产生TgCPL缺陷菌株（RH+ku80=cpl：：NLuc），并针对此突变体测量 LHVS 的抑制。通过观察TgCPL缺乏寄生虫中LHVS的IC₅₀值与WT菌株相比的向上变化，经验证TgCPL是LHVS体内的目标。

在此协议中，RH_ku80：：NLuc用作父母应变，缺乏有效的非同源端联通路（NHEJ），从而促进双交叉同源性重组（HDR）20，21。^20,21此外，50 bp 同源区域在 PCR 的耐药盒的两端侧翼。PCR 产品用作修复模板，使用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑工具通过 HDR 去除整个基因位点。这种短的同源区域可以很容易地集成到底漆中，为维修模板的生产提供了方便的策略。可以修改该协议，执行通用基因删除和内源基因标记。

例如，在我们最近的出版物中，三个蛋白酶基因，TgCPL，TgCPB（弓形体乙型蛋白酶）和TgSUB1（弓形体亚骨素样蛋白酶1），在TgCRT（弓形素氯奎酮抗药性运输器）中基因消解，缺乏寄生虫使用这种方法^15。 TgCPB此外，TgAMN（一种假定的氨肽酶N[TgAMN，TGGT1_221310]）被内质标记¹⁵。Lourido实验室还报告说，使用40-43bp范围内的短同源区域，使用类似的方法²²在弓形体基因组中引入位点基因突变和内源基因标记。这些成功的基因组修改表明，40-50bp同源区域足以在TgKU80缺陷菌株中进行有效的DNA重组，这大大简化了弓形虫腺的基因组操作。

Protocol

弓形虫贡迪被分类在风险组 2 中，必须在生物安全级别 2 （BSL-2） 处理。该议定书已得到克莱姆森大学机构生物安全委员会的审查和批准。 1. 基于路西法删除的弓形虫生长测定 在寄生虫接种前1周种子人类前皮成纤维细胞（HFFs），以确保宿主细胞完全融合。在透明板中进行模拟测定，以确保寄生虫在整个评估过程中保持细胞内。注：在这里，测定是在…

Representative Results

图 1表示 RH_ku80：：NLuc应变的生长曲线示例及其加倍时间的派生计算。通常，对三种生物复制进行三种技术复制，以解释荧光酶活性读数的变化。为了计算寄生虫生长的正化褶皱变化，每次在感染后24-96小时读数除以感染后4小时的初始读数，这反映了测定中活寄生虫的起始量（图1A，B）。在确定寄生虫…

Discussion

*本协议描述了一种基于荧光酶的协议，用于评估细胞内弓形虫的生长，并评估化合物对寄生虫生长的抑制作用。与现有的测量细胞内弓形虫生长的策略相比，该方法具有高灵敏度和特异性。在监测寄生虫生长时，建议在96孔微孔的模拟检测中确认测试菌株在评估期结束前不会过早压出宿主细胞。否则，发光读数将不能准确反映寄生虫的生长，因为弓形体只在宿主细胞内复制。<…

Materials

Agarose gel extraction kit	New England BioLabs	T1020L
BamHI	New England BioLabs	R0316S
Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader	BioTek Instuments
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System	Harvard Apparatus
Chemically competent E. coli cells	New England BioLabs	C29871
CloneAmp HiFi PCR premix	Takara Bio	639298
Coelenterazine h	Prolume	301-10 hCTZ
EcoRV	New England BioLabs	R3195S
Phire Tissue Direct PCR Master Mix	Thermo Scientific	F170L
Plasmid miniprep kit	Zymo Research	D4054
Q5 Site-Directed Mutagenesis kit	New England BioLabs	E0554S
Software
Geneious software for sgRNA design (version: R11)
GraphPad Prism software (8th version)
SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)