Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest
Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Bewertung der Hemmungswirksamkeit chemischer Verbindungen gegen in vitro intrazelluläres Wachstum von Toxoplasma gondii mit einem luziferase-basierten Wachstumstest. Die Technik wird verwendet, um die Hemmungsssspezifität durch genetische Deletion des entsprechenden Zielgens zu bestätigen. Die Hemmung von LHVS gegen TgCPL-Protease wird als Beispiel bewertet.
Abstract
Toxoplasma gondii ist ein Protozoen-Erreger, der die menschliche Bevölkerung stark betrifft. Die aktuellen Antibiotika zur Behandlung der klinischen Toxoplasmose sind begrenzt. Darüber hinaus zeigen sie Nebenwirkungen in bestimmten Gruppen von Menschen. Daher ist die Entdeckung neuartiger Therapeutika für die klinische Toxoplasmose unerlässlich. Der erste Schritt der neuartigen Antibiotikaentwicklung besteht darin, chemische Verbindungen zu identifizieren, die eine hohe Wirksamkeit bei der Hemmung des Parasitenwachstums zeigen, indem eine Screening-Strategie mit hohem Durchsatz verwendet wird. Als obligate intrazellulärer Erreger kann sich Toxoplasma nur innerhalb von Wirtszellen replizieren, was die Verwendung optischer Absorptionsmessungen als schneller Wachstumsindikator verbietet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für einen luziferase-basierten Wachstumstest vorgestellt. Als Beispiel wird diese Methode verwendet, um die Verdoppelungszeit von Toxoplasma-Parasiten des Typs Wildtyp zu berechnen und die Wirksamkeit von Morpholinurea-Leucyl-Homophenyl-Vinyl-Sulfonphenyl (LHVS, einer Cystein-Protease-targeting-Verbindung) in Bezug auf die Hemmung des intrazellulären Parasitenwachstums zu messen. Ebenfalls beschrieben ist ein CRISPR-Cas9-basiertes Gen-Löschprotokoll in Toxoplasma unter Verwendung von 50 bp homologen Regionen für homologieabhängige Rekombination (HDR). Durch die Quantifizierung der Hemmungswirksamkeiten von LHVS in Wildtyp und TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-defizienten Parasiten wird gezeigt, dass LHVS das Wildtyp-Parasitenwachstum effizienter hemmt als das Wachstum von Cpl, was darauf hindeutet, dass TgCPL ein Ziel ist, an das LHVS in Toxoplasmabindet. Die hohe Empfindlichkeit und einfache Operation dieses luziferase-basierten Wachstumstests machen es geeignet für die Überwachung der Toxoplasma-Proliferation und die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in einer hohen Durchsatz-Weise.
Introduction
Toxoplasma gondii ist ein sehr erfolgreicher obligate intrazellulärer Parasit, der etwa ein Drittel der menschlichen Bevölkerung infiziert. Seine hohe Übertragungsrate ist vor allem auf seine vielfältigen Übertragungswege zurückzuführen, einschließlich des Verzehrs von untergekochtem Fleisch, der Exposition gegenüber Säugetierreservoirs und der angeborenen Übertragung während der Geburt. T. gondii verursacht hauptsächlich opportunistische Infektionen, die zu schwerer Morbidität und Mortalität bei immungeschwächten Personen führen können1,2,3,4,5,6. Die Antibiotika, die derzeit zur Behandlung von akuter Toxoplasmose verwendet werden, sind besonders ineffizient bei der Behandlung angeborener und latenter Infektionen und verursachen bei einigen Personen schwere Reaktionen3,7,8. Daher besteht dringender Bedarf an der Identifizierung neuartiger Therapeutika. Das Verständnis der Unterschiede in subzellulären Prozessen innerhalb von Toxoplasma und seinem Wirt wird helfen, potenzielle Arzneimittelziele zu identifizieren. Daher sind effiziente und bequeme Genommanipulationstechniken erforderlich, um die Rolle einzelner Gene innerhalb von Toxoplasmazu untersuchen. Darüber hinaus gehört Toxoplasma zum Phylum Apicomplexa, das mehrere andere bedeutende menschliche Krankheitserreger umfasst, wie Plasmodium spp. und Cryptosporidium spp. Daher kann Toxoplasma als Modellorganismus verwendet werden, um grundlegende Biologie bei anderen apicomplexan Parasiten zu studieren.
Um neuartige Antibiotika gegen mikrobielle Krankheitserreger zu identifizieren, wird zunächst ein Hochdurchsatz-Screening einer Bibliothek chemischer Verbindungen durchgeführt, um ihre Wirksamkeit bei der Unterdrückung des mikrobiellen Wachstums zu bestimmen. Bisher wurden mehrere mikroplattenbasierte Wachstumstests zur Messung des intrazellulären Wachstums von T entwickelt. gondii (d.h. radioaktive 3H-Uracil-Inkorporations-basierte Quantifizierung9, quantitativeR ELISA-basierter Parasitennachweis mit T. gondii-spezifischen Antikörpern10,11, Reporter-Protein-basierte Messung mit den Toxoplasma-Stämmen 12,13und einem kürzlich entwickelten hochgehaltigen bildgebenden Assay14).
Diese individuellen Strategien haben alle einzigartige Vorteile; bestimmte Einschränkungen schränken jedoch auch ihre Anwendungen ein. Da sich Beispielsweise Toxoplasma nur innerhalb nukleierter Tierzellen replizieren kann, verursachen Autofluoreszenz und unspezifische Bindung von Anti-T.Gondii-Antikörpern an Wirtszellen Interferenzen in fluoreszenzbasierten Messungen. Darüber hinaus erfordert die Verwendung radioaktiver Isotope besondere Sicherheitsvorschriften und potenzielle Sicherheitsprobleme. Einige dieser Assays eignen sich eher für die Bewertung des Wachstums zu einem einzigen Zeitpunkt als für eine kontinuierliche Überwachung des Wachstums.
Hier wird ein auf Luziferase basierendes Protokoll zur Quantifizierung des intrazellulären Toxoplasmawachstums vorgestellt. In einer früheren Studie wurde das NanoLuc-Luziferase-Gen unter dem Toxoplasma-Tubulin-Promotor geklont, und dieses Luziferase-Expressionskonstrukt wurde in Wild-Typ-Parasiten (RH-ku80-hxg-Stamm) transfiziert,hxg um einen RH-Ku80-Hxg zu erzeugen ::NLuc-Stamm (bezeichnet alsku80RH-Ku80::NLuc im Folgenden)15. Toxoplasma ku80hxg Dieser Stamm diente als elterlicher Stamm für die intrazelluläre Wachstumsbestimmung und Genlöschung in dieser Studie. Mit demRH-Ku80::NLuc-Stamm, Parasitenwachstum in menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFFs) wurde über einen Zeitraum von 96 h nach der Infektion überwacht, um Parasiten-Verdoppelungszeit zu berechnen.
Darüber hinaus kann die Hemmungswirksamkeit von LHVS gegen Parasitenwachstum bestimmt werden, indem Toxoplasma-Wachstumsraten gegen serielle LHVS-Konzentrationen aufgezäunt werden, um den IC50-Wert zu identifizieren. Frühere Literatur hat berichtet, dass TgCPL ist ein wichtiges Ziel von LHVS bei Parasiten und dass die Behandlung mit LHVS verringert die Entwicklung von akuten und chronischen Toxoplasma-Infektionen 16,17,18,19. Zusätzlich wurdeRH-ku80::NLuc als elterlicher Stamm zur Genommodifikation verwendet, um einen TgCPL-Mangelstammzu erzeugen (RH-ku80-cpl::NLuc), und die Hemmung von LHVS wurde gegen diese Mutante gemessen.ku80 Durch die Beobachtung einer Upshift von IC50-Werten für LHVS in den TgCPL-mangelhaftenParasiten im Vergleich zum WT-Stamm wurde bestätigt, dass TgCPL von LHVS in vivo ins Visier genommen wird.
In diesem Protokoll wirdRH-ku80::NLuc als elterlicher Stamm verwendet, dem ein effizienter nicht-homologe Endverbindungsweg (NHEJ) fehlt, wodurch eine Doppelüber-Homologie-abhängige Rekombination (HDR)20,21ermöglicht wird. Zusätzlich werden 50 bp homologe Regionen an beiden Enden einer Arzneimittelresistenzkassette durch PCR flankiert. Das PCR-Produkt dient als Reparaturvorlage, um den gesamten Gen-Locus über HDR mit CRISPR-Cas9-basierten Genom-Editing-Tools zu entfernen. Solche kurzen homologen Regionen können leicht in Primer integriert werden, was eine bequeme Strategie für die Herstellung der Reparaturschablone bietet. Dieses Protokoll kann geändert werden, um universelle Genlöschung und endogene Gen-Tagging durchzuführen.
In unserer jüngsten Veröffentlichung wurden beispielsweise drei Proteasegene, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-like protease) und TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-like protease 1) genetisch in TgCRT (Toxoplasma Chloroquine-Resistance Transporter) -mangelhafte Parasiten mit dieser Methodeabgeschwächt 15. Zusätzlich wurde TgAMN (ein vermeintliches Aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogen mit15markiert. Das Lourido-Labor berichtete auch unter Verwendung kurzer homologe Regionen im Bereich von 40-43 bp für die Einführung von standortgesteuerter Genmutation und endogener Gen-Tagging im Toxoplasma-Genom mit einer ähnlichen Methode22. Diese erfolgreichen Genommodifikationen deuten darauf hin, dass eine homologe Region von 40-50 bp für eine effiziente DNA-Rekombination im TgKU80-Mangelstammausreicht, was die Genommanipulation in Toxoplasma gondiierheblich vereinfacht.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Dieses Protokoll beschreibt ein auf Luziferase basierendes Protokoll zur Bewertung des intrazellulären Toxoplasmawachstums und zur Bewertung der Hemmungswirksamkeit chemischer Verbindungen gegen Parasitenwachstum. Im Vergleich zu den bestehenden Strategien zur Messung des intrazellulären Toxoplasmawachstums weist diese Methode eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität auf. Während der Überwachung des Parasitenwachstums wird ein Mock-Assay in einer klaren 96-Well-Mikroplatte empfohlen, um zu bestä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Drs. Sibley und Carruthers für die gemeinsame Nutzung von pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT Plasmid und Anti-TgCPL- und TgActin-Antikörpern. Diese Arbeit wurde durch den Clemson Startup Fund (zu Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (zu Z.D.), ein Pilotstipendium eines NIH COBRE-Zuschusses P20GM109094 (bis Z.D.) und NIH R01AI143707 (bis Z.D.) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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