ルシファーゼベース成長アッセイを用いた細胞内トキソプラズマゴンディ成長に対する化学阻害剤の効率の測定
Summary
ここで提示されるプロトコルは、ルシファーゼベースの増殖アッセイを用いたトキソプラズマゴンディの細胞内成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するプロトコルである。この技術は、対応する標的遺伝子の遺伝的欠失による阻害特異性を確認するために用いられる。TgCPLプロテアーゼに対するLHVSの阻害を例として評価する。
Abstract
トキソプラズマゴンディは、ヒト集団に広く影響を与える原虫病原体である。臨床トキソプラズマ症の治療に使用される現在の抗生物質は限られています。さらに, 彼らは人々の特定のグループに悪影響を示します。.したがって、臨床的トキソプラズマ症に対する新規治療薬の発見が不可欠である。新しい抗生物質の開発の最初のステップは、高スループットスクリーニング戦略を用いて寄生虫増殖の阻害において高い有効性を示す化合物を同定することです。細胞内病原体として、トキソプラズマは宿主細胞内でのみ複製することができ、成長の迅速な指標として光学吸光度測定の使用を禁止しています。ここで提示されるルシファーゼベースの成長アッセイのための詳細なプロトコルです。一例として、野生型トキソプラズマ寄生虫の倍増時間を計算し、細胞内増殖の阻害に関するモルホリン尿素-ロイシル-ホモフェニルビニル・スルホンフェニル(LHVS、システインプロテアーゼ標的化合物)の有効性を測定するために使用されます。また、ホモロジー依存組換え(HDR)に50bp相同領域を用いたトキソプラズマにおけるCRISPR-Cas9ベースの遺伝子欠失プロトコルである。野生型およびTgCPL(トキソプラズマカテプシンL様プロテアーゼ)欠損性寄生虫におけるLHVSの阻害効果を定量化することにより、LHVSがΔcpl増殖よりも効率的に野生型寄生虫の増殖を阻害することが示され、TgCPLがThVSがトホソプラズマ中に結合する標的であることを示唆している。このルシファーゼベースの増殖アッセイの高感度かつ容易な操作により、トキソプラズマの増殖をモニタリングし、高スループットでの薬剤有効性の評価に適しています。
Introduction
トキソプラズマ・ゴンディは、ヒト集団の約3分の1に感染する、非常に成功した細胞内寄生虫です。その高い伝染率は、主に、調理されていない肉の消費、哺乳類の貯水池への暴露、出生時の先天性伝染を含む多様な伝染経路によるものである。T. gondiiは主に、免疫不全個体,,11、2、3、4、5、62,3において重度の罹患率および死亡率を引き起こす可能性のある日和見感染5を6引き起こす。4急性トキソプラズマ症の治療に現在使用されている抗生物質は、特に先天性および潜在感染の治療において非効率的であり、一部の個体33、7、87,8において重篤な反応を引き起こす。したがって、新しい治療法を同定する緊急の必要性が存在する。トキソプラズマとその宿主における細胞内プロセスの違いを理解することは、潜在的な薬物標的を特定するのに役立ちます。したがって、トキソプラズマ内の個々の遺伝子の役割を研究するために、効率的で便利なゲノム操作技術が必要である。さらに、トキソプラズマは、プラスモジウム属やクリプトスポリジウム属などの他のいくつかの重要なヒト病原体を含むフィラム・アピコンプレックスに属しています。したがって、トキソプラズマは、他のアピコンプレックス寄生虫の基礎生物学を研究するのに役立つモデル生物として使用することができます。
微生物病原体に対する新規の抗生物質を同定するために、化学化合物のライブラリーのハイスループットスクリーニングは、微生物増殖の抑制におけるその有効性を決定するために最初に行われる。これまでに、Tの細胞内成長を測定するために、マイクロプレートベースの成長アッセイがいくつか開発されてきました。 gondii(すなわち、放射性3H-ウラシル系組み込み定量9、T.ゴンディ特異的抗体10、11を用いた定量ELISAベースの寄生虫検出、β-ガラクトシダーゼまたはYFP発現トキソプラズマ株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化性株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化物を用いたT.ゴンディ特異的抗体12,10、11、レポータータンパク質ベースの測定を行う。13
これらの個々の戦略はすべてユニークな利点を持っています。ただし、一部の制限によってアプリケーションが制限されます。例えば、トキソプラズマは有核動物細胞内でのみ複製できるため、宿主細胞に対する抗T.ゴンディ抗体の自己蛍光および非特異的結合は、蛍光ベースの測定において干渉を引き起こす。また、放射性同位体の使用には、特別な安全コンプライアンスと潜在的な安全上の問題が必要です。これらのアッセイの中には、成長の継続的なモニタリングではなく、単一の時点で成長を評価するのに適したものもある。
ここで提示される細胞内トキソプラズマの増殖の定量化のためのルシメラーゼベースのプロトコルです。以前の研究では、NanoLucルシファーゼ遺伝子をトキソプラズマチューブリンプロモーターの下でクローニングし、このルシファーゼ発現構築物を野生型(RHΔhxg株)hxg寄生虫にトランスフェクトku80してRHΔhxgをku80作成しました::NLuc株(RHΔku80::NLuc以降)15。hxgNLucこの株は、この研究で細胞内増殖決定および遺伝子欠失のための親株として役立った。RHΔku80を用いて::NLuc株は、ヒト包皮線維芽細胞(HPF)の寄生虫増殖を96時間にわたってモニタリングし、寄生虫の倍増時間を算出した。
さらに、寄生虫増殖に対するLHVSの阻害効果は、IC50値を同定するために、シリアルLHVS濃度に対するトキソプラズマ増殖率をプロットすることによって決定することができる。以前の文献は、TgCPLが寄生虫におけるLHVSの主要な標的であり、LHVSによる治療が急性および慢性トキソプラズマ感染の発症を減少させることが報告されている16、17、18、19。16,17,18,19さらに、RHΔku80 ::NLucは、TgCPL欠損株(RHΔcpl::NLuc)を生成するゲノム改変のための親株cplとして使用され、NLucこの変異体に対するLHVSの阻害を測定した。ku80ku80WT株と比較してTgCPL-欠損性寄生虫におけるLHVSのIC50値のアップシフトを観察することにより、TgCPLがインビボのLHVSによって標的とされることを検証した。
このプロトコルにおいて、RHΔku80::NLucは、効率的な非相同的な末端結合経路(NHEJ)を欠く親株として使用され、それによって二重交差相同性依存組換え(HDR)20,21を促進する。20,21さらに、50 bpの相同領域は、PCRにより薬剤耐性カセットの両端に横たわっています。PCR製品は、CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集ツールを使用してHDRを介して遺伝子遺伝子軌跡全体を除去するための修復テンプレートとして機能します。このような短い相同領域は、簡単にプライマーに組み込むことができるので、修復テンプレートの製造に便利な戦略を提供します。このプロトコルは、普遍的な遺伝子欠失および内因性遺伝子タグ付けを行うために変更することができる。
例えば、最新の出版物では、TgCPL、TgCPB(トキソプラズマカテプシンBTgCPB様プロテアーゼ)、TgSUB1(トキソプラズマサブチライシン様プロテアーゼ1)の3つのプロテアーゼ遺伝子が、TgCRT(トキソプラズマクロロキン耐性輸送体)で遺伝的に可軟化した。 TgSUB1また、TgAMN(推定アミノペプチダーゼN[TgAMN,TGGT1_221310])を内因的に15にタグ付けした。Louridoラボはまた、トキソプラズマゲノムにおける部位指向遺伝子変異および内因性遺伝子タグの導入に40〜43bpの範囲で短い相同領域を用いて、同様の方法22を用いて報告した。これらの成功したゲノム改変は、40-50bp相同領域がTgKU80欠損株における効率的なDNA組換えに十分であり、トキソプラズマ・ゴンディにおけるゲノム操作を大幅に簡素化することを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
++このプロトコルは、細胞内トキソプラズマの成長を評価し、寄生虫の成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するルシファーゼベースのプロトコルを記述します。細胞内トキソプラズマの成長を測定するために利用可能な既存の戦略と比較して、この方法は高感度および特異性を示す。寄生虫の成長を監視している間、明確な96ウェルマイクロプレートの模擬アッセイは、試…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、pSAG1-Cas9-SgRNA-TgUPRTプラスミドおよび抗TgCPLおよびTgActin抗体を共有してくれたシブリー博士とカルーサーズ博士に感謝したいと考えています。この研究は、クレムソンスタートアップファンド(Z.D.へ)、ナイツテンプラー眼科財団小児眼科キャリアスターター研究助成金(Z.D.)、NIH COBRE助成金P20GM109094(Z.D.)、NIH R01AI143707(Z.D.へ)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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