Bestämning av kemisk hämmare effektivitet mot intracellulära Toxoplasma Gondii tillväxt med hjälp av en Luciferase-baserad tillväxt analys
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utvärdera hämning effekten av kemiska föreningar mot in vitro intracellulära tillväxten av Toxoplasma gondii med hjälp av en luciferase-baserad tillväxt analys. Tekniken används för att bekräfta hämningss specificitet genom genetisk borttagning av motsvarande målgen. Hämningen av LHVS mot TgCPL proteas utvärderas som ett exempel.
Abstract
Toxoplasma gondii är en protozoisk patogen som i stor utsträckning påverkar den mänskliga befolkningen. De nuvarande antibiotika som används för behandling av klinisk toxoplasmos är begränsade. Dessutom uppvisar de negativa biverkningar i vissa grupper av människor. Därför är upptäckten av nya therapeutics för kliniska toxoplasmos absolut nödvändigt. Det första steget i nya antibiotika utveckling är att identifiera kemiska föreningar som visar hög effekt i hämning av parasittillväxt med hjälp av en hög genomströmning screening strategi. Som en obligate intracellulär patogen, Toxoplasma kan endast replikera inom värdceller, vilket förbjuder användning av optisk absorbans mätningar som en snabb indikator på tillväxt. Presenteras här är ett detaljerat protokoll för en luciferas-baserad tillväxt analys. Som ett exempel används denna metod för att beräkna fördubblingstiden för toxoplasmaparasiter av vildtyp och mäta effekten av morpholinurea-leucyl-homofenyl-vinylsulfonfenyl (LHVS, en cysteinproteas-inriktningsförening) avseende hämning av parasitens intracellulära tillväxt. Beskrivs också, är en CRISPR-Cas9-baserade gen radering protokoll i Toxoplasma med 50 bp homologa regioner för homologi-beroende rekombination (HDR). Genom att kvantifiera hämningseffektiviteten hos LHVS i vilda och TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-liknande proteas)-bristfälliga parasiter, visas det att LHVS hämmar parasittillväxt av vild typ mer effektivt än Δcpl-tillväxt, vilket tyder på att TgCPL är ett mål som LHVS binder till i Toxoplasma. Den höga känsligheten och den enkla driften av denna luciferasbaserade tillväxtanalys gör den lämplig för övervakning av Toxoplasma-spridning och utvärdering av läkemedelseffekt på ett högt genomflödessätt.
Introduction
Toxoplasma gondii är en mycket framgångsrik obligate intracellulär parasit som infekterar ungefär en tredjedel av den mänskliga befolkningen. Dess höga överföringshastighet beror främst på dess olika överföringsvägar, inklusive konsumtion av underkokt kött, exponering för däggdjursreservoarer och medfödd överföring under födseln. T. gondii orsakar främst opportunistiska infektioner som kan leda till allvarlig sjuklighet och dödlighet hos immunkomprometterade individer1,,2,,3,,4,,5,6. De antibiotika som för närvarande används för behandling av akut toxoplasmos är särskilt ineffektiva vid behandling av medfödda och latenta infektioner och orsaka allvarliga reaktioner hos vissa individer3,,7,8. Således finns ett akut behov av att identifiera nya terapier. Förstå skillnaderna i subcellulära processer inom Toxoplasma och dess värd kommer att bidra till att identifiera potentiella läkemedelsmål. Därför krävs effektiva och bekväma genommanipulationstekniker för att studera rollerna hos enskilda gener inom Toxoplasma. Dessutom tillhör Toxoplasma fylum Apicomplexa, som innehåller flera andra signifikanta mänskliga patogener, såsom Plasmodium spp. och Cryptosporidium spp. Därför kan Toxoplasma användas som en modell organism för att studera grundläggande biologi i andra apicomplexan parasiter.
För att identifiera nya antibiotika mot mikrobiella patogener utförs initialt screening av ett bibliotek av kemiska föreningar för att bestämma deras effekt vid förtrycket av mikrobiell tillväxt. Hittills har flera mikroplatbaserade tillväxtanalyser utvecklats för att mäta intracellulär tillväxt av T. gondii (dvs. radioaktiva 3H-uracil inkorporering-baserad kvantifiering9, kvantitativ ELISA-baserad parasit upptäckt med T. gondii-specifikaantikroppar10,11, reporter proteinbaserad mätning med β-galactosidase eller YFP-uttryck Toxoplasma stammar12,,13, och en nyligen utvecklad hög-content imaging analys analys14).
Dessa individuella strategier har alla unika fördelar; Vissa begränsningar begränsar dock också deras ansökningar. Till exempel, eftersom Toxoplasma endast kan replikera inom nukleerade djurceller, autofluorescens och icke-specifik bindning av anti-T. gondii antikroppar mot värdceller orsaka störningar i fluorescens-baserade mätningar. Dessutom kräver användning av radioaktiva isotoper särskild säkerhetsöverensstämmelse och potentiella säkerhetsfrågor. Några av dessa analyser är mer lämpade för att bedöma tillväxt vid en enda tidpunkt snarare än kontinuerlig övervakning av tillväxten.
Presenteras här är en luciferase-baserade protokoll för kvantifiering av intracellulära Toxoplasma tillväxt. I en tidigare studie klonades NanoLuc luciferase genen under Toxoplasma tubulin promotorn, och denna luciferas uttryck konstruktion transfekterades i vildtyp (RHΔku80Δhxg stam) parasiter för att skapa en RHΔku80Δhxg::NLuc stam (kallad RHΔku80::NLuc nedan)15. Denna stam fungerade som föräldrarnas stam för intracellulär tillväxt bestämning och gen borttagning i denna studie. Med hjälp av RHΔku80::NLuc stam, parasit tillväxt i mänskliga förhud fibroblaster (HFFs) övervakades under en 96 h period efter infektion för att beräkna parasit fördubbling tid.
Dessutom kan hämningseffekten av LHVS mot parasittillväxt bestämmas genom att rita Toxoplasma tillväxthastigheter mot seriella LHVS-koncentrationer för att identifiera IC50-värdet. Tidigare litteratur har rapporterat att TgCPL är ett viktigt mål för LHVS i parasiter och att behandling med LHVS minskar utvecklingen av akuta och kroniska Toxoplasma infektioner16,17,18,19. Dessutom, RHΔku80::NLuc användes som föräldrastam för genom modifiering för att generera en TgCPL-briststam (RHΔku80Δcpl::NLuc), och hämningen av LHVS mättes mot denna mutant. Genom att observera en uppväxling av IC50 värden för LHVS i TgCPL-bristfälligaparasiter jämfört med WT stam, validerades det att TgCPL är måltavla för LHVS in vivo.
I detta protokoll, RHΔku80::NLuc används som föräldrastam, som saknar en effektiv icke-homolog end-joining pathway (NHEJ), vilket underlättar dubbel crossover homologi-beroende rekombination (HDR)20,21. Dessutom, 50 bp homologa regioner flankeras i båda ändar av en läkemedelsresistens kassett av PCR. PCR-produkten fungerar som en reparationsmall för att ta bort hela genen locus via HDR med CRISPR-Cas9-baserade genomredigeringsverktyg. Sådana korta homologa regioner kan lätt införlivas i primers, vilket ger en bekväm strategi för produktion av reparationsmallen. Detta protokoll kan ändras för att utföra universell genborttagning och endogen gentaggning.
Till exempel, i vår senaste publikation, tre proteas gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-liknande proteas), och TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-liknande proteas 1), var genetiskt ablated i TgCRT (Toxoplasma kloroquine-resistens transportör)-bristfälliga parasiter med denna metod15. Dessutom, TgAMN (en förmodad aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) var endogent taggade15. Den Lourido lab rapporterade också med hjälp av korta homologa regioner i intervallet 40-43 bp för införandet av plats-riktad genmutation och endogena genmärkning i Toxoplasma genomet med en liknande metod22. Dessa framgångsrika genom ändringar tyder på att en 40-50 bp homolog region är tillräcklig för effektiv DNA-rekombination i TgKU80-briststam, vilket kraftigt förenklar genom manipulation i Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
++Detta protokoll beskriver ett luciferasbaserat protokoll för att bedöma intracellulär Toxoplasmatillväxt och utvärdera hämningseffekten av kemiska föreningar mot parasittillväxt. Jämfört med de befintliga strategier som finns tillgängliga för att mäta intracellulär Toxoplasma tillväxt, uppvisar denna metod hög känslighet och specificitet. Vid övervakning av parasitens tillväxt rekommenderas en mock-analys i en tydlig 96-brunnsmikroplate för att bekräfta att den testade stammen int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Drs. Sibley och Carruthers för att dela pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid och anti-TgCPL och TgActin antikroppar. Detta arbete stöddes av Clemson Startup fond (till Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmologi Career-Starter Research Grant (till Z.D.), ett pilotbidrag av en NIH COBRE bidrag P20GM109094 (till Z.D.), och NIH R01AI143707 (till Z.D.). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
