मस्तिष्क स्लाइस में और प्राथमिक सेल संस्कृति में पिरामिड न्यूरॉन्स की बैलिस्टिक लेबलिंग
Summary
हम पिरामिड न्यूरॉन्स को लेबल और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई में संभावित रूपात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है जो न्यूरोकेमिकल और व्यवहार असामान्यताओं को आबाद कर सकता है।
Abstract
यह बताया गया है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है। पिरामिड न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक संरचना की पहचान करने के लिए, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, पिरामिड न्यूरॉन्स को दिलसी18 (3) रंग से लेबल किया जाता है और न्यूरोनल मॉर्फोलॉजी और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के लिए न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। न्यूरोनल संरचना की जांच करने के लिए, डेंड्रिटिक ब्रांचिंग विश्लेषण और Sholl विश्लेषण किया जाता है, जिससे शोधकर्ताओं को क्रमशः डेन्ड्रिटिक ब्रांचिंग जटिलता और न्यूरोनल आर्बर जटिलता के बारे में अनुमान आकर्षित करने की अनुमति मिलती है। डेन्ड्रिटिक कताई का मूल्यांकन पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के अभिन्न अंग के स्वचालित सहायता प्राप्त वर्गीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके किया जाता है, जो चार श्रेणियों (यानी, पतली, मशरूम, ठूंठ, फिलोपोडिया) में कताई को वर्गीकृत करता है। इसके अलावा, एक अतिरिक्त तीन मापदंडों (यानी, लंबाई, सिर व्यास, और मात्रा) भी डेंड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान में परिवर्तन का आकलन करने के लिए चुना जाता है । बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता को मान्य करने के लिए, इन विट्रो सेल संस्कृति से पिरामिड न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक लेबल किए गए थे। कुल मिलाकर, बैलिस्टिक लेबलिंग विधि चूहों में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए अद्वितीय और उपयोगी है, जो परिष्कृत पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के संयोजन में, शोधकर्ताओं को अंतर्निहित संभावित तंत्र को स्पष्ट करने की अनुमति देता है न्यूरोकॉग्निटिव डिसफंक्शन।
Introduction
2000 में, गन एट अल तंत्रिका तंत्र में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और ग्लिया के लिए एक रैपिड लेबलिंग तकनीक का वर्णन किया गया है जो विभिन्न लिपोफिलिक रंगों को संयुक्त करता है, जिससे विभिन्न रंगों के साथ कई मस्तिष्क कोशिकाओं की एक साथ लेबलिंगकीअनुमति1,2। हाल ही में, एक बैलिस्टिक लेबलिंग तकनीक Seabold एट अल3 द्वारा वर्णित किया गया था कि मस्तिष्क स्लाइस के न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट रंगों (दिल) शुरू की । एक बहुमुखी धुंधला तकनीक, बैलिस्टिक लेबलिंग कई पशु प्रजातियों में और उम्र की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग करने की क्षमता के लिए सराहना की है । इसके अलावा, इसे मस्तिष्क कोशिकाओंकीउपआबादी 3 की पहचान करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। पारंपरिक तकनीकों (उदाहरण के लिए, गोलगी-कॉक्स सिल्वर इम्प्रोगम, माइक्रोइंजेक्शन)4की तुलना में, बैलिस्टिक लेबलिंग में डेंड्रिटिक कताई सहित रूपात्मक विशेषताओं को अधिक स्पष्ट रूप से अलग करने का अवसर मिलता है, एक विशेषता जो न्यूरोनल जटिलता और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5के बारे में अनुमान लगाने के लिए महत्वपूर्ण है।
एक्सेक्टेरी पिरामिड न्यूरॉन्स एक एकल, बड़े एपिकल डेंडराइट, कई छोटे बेसल डेन्डराइट्स, और हजारों डेन्ड्रिटिक कताई6की विशेषता है। पिरामिड न्यूरॉन्स उच्च क्रम संज्ञानात्मक प्रसंस्करण से संबंधित कई मस्तिष्क क्षेत्रों में पाए जाते हैं, जिसमें प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) और हिप्पोकैम्पस शामिल हैं। पीएफसी में, पिरामिड न्यूरॉन्स परतों द्वितीय/III और परत वी में मनाया जाता है, प्रत्येक अद्वितीय आकृति विज्ञान का प्रदर्शन के साथ । विशेष रूप से, पीएफसी की परत II/III में पिरामिड न्यूरॉन्स परत V6में पिरामिड न्यूरॉन्स की तुलना में एक छोटे एपिकल डेंराइट और कम शाखाओं में बंटी है । हिप्पोकैम्पस के भीतर, पिरामिड न्यूरॉन्स सीए 1 और सीए 3 दोनों क्षेत्रों में स्थित हैं, जिनमें से प्रत्येक अलग-अलग मॉर्मोलोजी प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, CA1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स एक अधिक विशिष्ट एपिकल डेंडराइट प्रदर्शित करते हैं, जिसमें सीए 3 क्षेत्र6के सापेक्ष सोमा से आगे होने वाली शाखाओं में बंटी होती है।
पीएफसी और हिप्पोकैम्पस दोनों में पिरामिड न्यूरॉन्स पर डेंड्रिटिक कताई एक्साइटरी सिनेप्स7का प्राथमिक स्थल है। डेंड्रिटिक कताई की रूपात्मक विशेषताएं, जिन्हें शास्त्रीय रूप से तीन प्राथमिक श्रेणियों (यानी, पतली, ठूंठ या मशरूम8)में चित्रित किया गया है, एक्सेक्टेटरी सिनेप्स9के आकार से संबंधित हैं। पतली कताई, एक लंबी, पतली गर्दन, छोटे बल्बस सिर, और छोटे पोस्टसिनैप्टिक घनत्व की विशेषता, अधिक अस्थिर हैं और कमजोर कनेक्शन विकसित करते हैं। हालांकि, मशरूम कताई, जिसमें एक बड़ा डेंड्रिटिक रीढ़ सिर होता है, मजबूत सिनैप्टिक कनेक्शन बनाने के लिए पहचाना जाता है, जो उनके बड़े आकार के परिणामस्वरूप प्रभाव होता है। इसके विपरीत, ठूंठ कताई रीढ़ की गर्दन से रहित होती है, जो लगभग समान सिर और गर्दन की मात्रा अनुपात8का प्रदर्शन करती है। हिप्पोकैम्पस के भीतर, शाखाओं में बंटी कताई भी देखी जा सकती है, जिससे रीढ़ की हड्डी में कई सिर होते हैं जो एक ही डेंड्रिटिक रीढ़ की गर्दन10से निकलते हैं। इसलिए, डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक परिवर्तन कार्यक्षमता और संरचनात्मक क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि डेंड्रिटिक कताई का आकार और आकार उनकी संरचनात्मक प्लास्टिसिटी से संबंधित है, जिससे यह विचार होता है कि छोटे कताई सीखने और ध्यान में शामिल हैं, जबकि बड़े, अधिक स्थिर कताई, स्मृति11सहित दीर्घकालिक प्रक्रियाओं में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, डेंड्राइट के साथ डेंड्रिटिक कताई का वितरण सिनैप्टिक कनेक्टिविटी5,,12से जुड़ा हो सकता है।
इस प्रकार, वर्तमान पद्धतिविज्ञान पत्र के तीन लक्ष्य हैं: 1) बैलिस्टिक लेबलिंग के लिए हमारे प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करें, जिसका उपयोग सफलता दर (यानी, न्यूरॉन्स मीटिंग चयन मानदंड और विश्लेषण के लिए उपयुक्त) के साथ किया गया है) 83.3%5,,12,,13 और कई मस्तिष्क क्षेत्रों (यानी, पीएफसी, नाभिक एक्यूबेन्स, हिप्पोकैम्पस) में); 2) तकनीक की सामान्यता और विट्रो में उगाए गए न्यूरॉन्स के लिए इसके आवेदन को प्रदर्शित करें; 3) न्यूरोनल पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में उपयोग की गई पद्धति और ऐसे डेटा से तैयार किए जा सकने वाले निष्कर्षों का विस्तार करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम चूहे के मस्तिष्क और विट्रो में उगाए गए दोनों न्यूरॉन्स के लिए एक बहुमुखी लेबलिंग तकनीक का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम न्यूरोनल आकृति विज्ञान और डेंड्रिटिक कताई का आकलन करने के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच ग्रांट एचडी043680, MH106392, DA013137 और NS100624 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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