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의학

Évaluation histomorphométrique normalisée de l’arthrose dans un modèle chirurgical de souris

Published: May 06, 2020
doi:
10.3791/60991
, , , , , , ,
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation,Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology,Pennsylvania State College of Medicine

Summary

Le protocole actuel établit une méthode rigoureuse et reproductible pour la quantification des changements articulaires morphologiques qui accompagnent l’arthrose. L’application de ce protocole peut être utile en surveillant la progression de la maladie et en évaluant les interventions thérapeutiques dans l’arthrose.

Abstract

L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose (ARTH) se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui a des répercussions importantes sur la mobilité des patients et la qualité de vie. À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative existante pour l’œud de œvé capable de ralentir ou d’inhiber la dégénérescence du cartilage. À l’heure actuelle, il existe un vaste ensemble de recherches en cours pour comprendre la pathologie de l’œd de l’œil et découvrir de nouvelles approches thérapeutiques ou des agents qui peuvent ralentir efficacement, arrêter ou même inverser l’œd de soi. Ainsi, il est crucial d’avoir une approche quantitative et reproductible pour évaluer avec précision les changements pathologiques associés à l’OA dans le cartilage articulaire, le synovium et l’os subchondral. À l’heure actuelle, la gravité et la progression de l’arthrose sont principalement évaluées à l’aide des systèmes internationaux de recherche sur l’arthrose (OARSI) ou Mankin. Malgré l’importance de ces systèmes de notation, ils sont semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils, mais importants, dans le cartilage au cours des premiers états de la maladie ou des phases de traitement précoce. Le protocole que nous décrivons ici utilise un système logiciel histomorphométrique informatisé et semi-automatisé pour établir une méthodologie quantitative normalisée, rigoureuse et reproductible pour l’évaluation des changements conjoints dans l’arthrose. Ce protocole présente un ajout puissant aux systèmes existants et permet une détection plus efficace des changements pathologiques dans l’articulation.

Introduction

L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui entraîne des impacts significatifs sur la mobilité des patients et la qualité de vie1,2,3. Le cartilage articulaire est le tissu conjonctif spécialisé des articulations diarthrodiales conçues pour minimiser la friction, faciliter le mouvement et supporter la compression articulaire4. Le cartilage articulaire est composé de deux composants primaires : les chondrocytes et la matrice extracellulaire. Les chondrocytes sont des cellules spécialisées et métaboliquement actives qui jouent un rôle principal dans le développement, l’entretien et la réparation de la matrice extracellulaire4. L’hypertrophie chondrocyte (CH) est l’un des principaux signes pathologiques du développement de l’œd de l’œux. Il est caractérisé par l’augmentation de la taille cellulaire, la diminution de la production de protéoglycan, et l’augmentation de la production d’enzymes de matrice de cartilage dégradant qui mènent par la suite à la dégénérescence du cartilage5,6,7. En outre, les changements pathologiques dans l’os et le synovium subchondral de l’articulation jouent un rôle important dans le développement et la progressionde l’OV 8,9,10,11,12. À ce jour, il n’existe pas de thérapies curatives existantes qui inhibent la dégénérescence du cartilage1,2,3,13,14. Ainsi, il existe des recherches approfondies en cours qui visent à comprendre la pathologie de l’œa et à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques qui sont capables de ralentir ou même d’arrêter l’œd de l’œil. En conséquence, il y a un besoin croissant pour une approche quantitative et reproductible qui permet l’évaluation précise des changements pathologiques oA-associés dans le cartilage, le synovium, et l’os subchondral de l’articulation.

Actuellement, la gravité et la progression de l’œd de l’œux sont principalement évaluées à l’aide des systèmes de notation OARSI ou Mankin15. Cependant, ces systèmes de notation ne sont que semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils qui se produisent dans l’articulation pendant la maladie ou en réponse à une manipulation génétique ou une intervention thérapeutique. Il y a des rapports sporadiques dans la littérature décrivant des analyses histomorphométriques du cartilage, du synovium, ou de l’os subchondral16,17,18,19,20,21. Cependant, un protocole détaillé pour l’analyse histomorphométrique rigoureuse et reproductible de tous ces composants articulaires fait encore défaut, créant un besoin non satisfait sur le terrain.

Pour étudier les changements pathologiques dans l’arthrose à l’aide de l’analyse histomorphométrique, nous avons utilisé un modèle chirurgical de souris oA pour induire l’arthrose par déstabilisation du ménisque médial (DMM). Parmi les modèles établis de l’OA murine, DMM a été sélectionné pour notre étude parce qu’il implique un mécanisme moins traumatique de la blessure22,23,24,25,26. Par rapport aux blessures ménisque-ligamentaires (MLI) ou aux chirurgies antérieures des ligaments croisés (ACLI), DMM favorise une progression plus graduelle de l’OA, similaire au développement de l’OA chez l’homme22,24,25,26. Les souris ont été euthanasiées douze semaines après chirurgie de DMM pour évaluer des changements dans le cartilage articulaire, l’os subchondral, et le synovium.

L’objectif de ce protocole est d’établir une approche normalisée, rigoureuse et quantitative pour évaluer les changements conjoints qui accompagnent l’œil de sécurité.

Protocol

Des souris mâles de 12 semaines C57BL/6 ont été achetées auprès de Jax Labs. Toutes les souris ont été logées dans des groupes de 3-5 souris par cage de micro-isolateur dans une pièce avec un programme clair/foncé de 12 h. Toutes les procédures animales ont été effectuées selon le National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie. <p class="jove_ti…

Representative Results

L’OA induit par DMM entraîne une dégénérescence articulaire du cartilage et une perte de chondrocyteL’OA induit par le DMM a entraîné une augmentation du score d’OARSI par rapport aux souris simulées, caractérisées distinctement par l’érosion de surface et la perte de cartilage(figure 1A,D). Le protocole d’histomorphométrie détaillé ici a détecté plusieurs changements associés à l’OA, y compris une diminution de la région to…

Discussion

La recherche récente sur l’arthrose a amélioré notre compréhension de la traque entre les différents tissus de l’articulation et le rôle que chaque tissu joue dans l’initiation ou la progression de la maladie8,9,10,35,36. Par conséquent, il est devenu évident que l’évaluation de l’œil ne devrait pas se limiter à l’analyse du cartilage, m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier l’aide du personnel du Département de médecine comparée et du noyau moléculaire et histopathologique du Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Sources de financement : NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher Chemical SF100-20 For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) Fisher Chemical A38S-212 For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% Acros Organics AC446080010 For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain SIGMA Life Sciences F7258 For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15 For sample section collection
HistoPrep Xylene Fisherbrand HC-700-1GAL For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base Fisher 15-182-701A For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation HP Product number: Y5C77US#ABA For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome Leica RM 2235 For sample sectioning
Marking pens Leica 3801880 For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter Thermo Scientific STARA2110 For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software OsteoMetrics https://www.osteometrics.com/index.htm For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system Leica Model # 39471005 For mouse knee harvest
PRISM 7 Software GraphPad Institutional Access Account Statistical Analysis
Safranin-O stain SIGMA Life Sciences S8884 For sample staining
ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A Fisher 5029713 For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B Fisher 5029714 For hematoxylin staining
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References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O’Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

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Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).
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