Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per la produzione di fette di fegato tagliate di precisione dai topi. I campioni di tessuto ex vivo possono essere mantenuti in condizioni di coltura dei tessuti di laboratorio per più giorni, fornendo un modello flessibile per esaminare la patobiologia epatica.
Abstract
Comprendere i meccanismi di lesioni epatiche, fibrosi epatica e cirrosi che sono alla base di malattie epatiche croniche (cioè epatite virale, malattia epatica grassa non alcolica, malattia metabolica del fegato e cancro al fegato) richiede la manipolazione sperimentale di modelli animali e colture in vitro cellulari. Entrambe le tecniche hanno limitazioni, come il requisito di un gran numero di animali per la manipolazione in vivo. Tuttavia, le colture cellulari in vitro non riproducono la struttura e la funzione dell’ambiente epatico multicellulare. L’uso di fette di fegato tagliate con precisione è una tecnica in cui fette uniformi di fegato di topo vitale vengono mantenute nella coltura dei tessuti di laboratorio per la manipolazione sperimentale. Questa tecnica occupa una nicchia sperimentale che esiste tra gli studi sugli animali e i metodi di coltura delle cellule in vitro. Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per isolare e coltura le fette di fegato tagliate con precisione dai topi. Come applicazione di questa tecnica, le fette di fegato ex vivo vengono trattate con acidi biliari per simulare lesioni epatiche colestatiche e, infine, valutare i meccanismi della fibrogenesi epatica.
Introduction
La patogenesi della maggior parte delle malattie epatiche croniche (cioè l’epatite virale, la steatoepatite analcolica, la lesione epatica colestatica e il cancro al fegato) comporta complesse interazioni tra più diversi tipi di cellule epatiche che guidano infiammazione, fibrogenesi e sviluppo del cancro1,2. Per comprendere i meccanismi molecolari alla base di queste malattie croniche a base di fegato, è necessario studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Mentre più linee cellulari epatiche (e più recentemente, organoidi) possono essere coltivate in vitro, questi modelli non emulano con precisione la struttura complessa, la funzione e la diversità cellulare del microambiente epatico3. Inoltre, le cellule epatiche coltivate (in particolare, linee cellulari trasformate) possono discostarsi dalla loro biologia originale. I modelli animali vengono utilizzati sperimentalmente per studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Tuttavia, possono diventare significativamente ridotti nel margine di manipolazione sperimentale, a causa di significativi effetti fuori bersaglio negli organi extraepatici (ad esempio, durante il test di potenziali terapie).
L’uso di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) nella coltura tissutale è una tecnica sperimentale utilizzata per la prima volta negli studi di metabolismo e tossicità dei farmaci, e comporta il taglio di fette di fegato vitali e ultrasottili (circa 100-250 m di spessore). Questo permette la manipolazione sperimentale diretta del tessuto epatico ex vivo4. La tecnica colma un divario sperimentale tra gli studi sugli animali in vivo e i metodi di coltura delle cellule in vitro, superando molti inconvenienti di entrambi i metodi (cioè limiti pratici sulla gamma di esperimenti che possono essere eseguiti in animali interi, nonché la perdita di struttura/funzione e diversità cellulare con metodi di coltura in vitro cell).
Inoltre, il PCLS aumenta notevolmente la capacità sperimentale rispetto agli studi sugli animali interi. Come un topo può produrre più di 48 fette di fegato, questo facilita anche l’uso di entrambi i gruppi di controllo e di trattamento dallo stesso fegato. Inoltre, la tecnica separa fisicamente il tessuto epatico da altri sistemi di organi; pertanto, rimuove i potenziali effetti fuori bersaglio che possono verificarsi in animali interi durante il test degli effetti degli stimoli esogeni.
In questo protocollo, PCLS vengono generati utilizzando un vibratome con una lama vibrante lateralmente. Altri studi hanno usato con successo un affettatrice di tessuto Krumdieck, come descritto in Olinga e Schuppan5. Nel vibratome, la vibrazione laterale della lama impedisce lo strappo del tessuto ultrasottile causato dallo stress di taglio, poiché la lama viene spinta nel tessuto. Sia il vibratome che l’affettatrice di tessuto Krumdieck funzionano in modo efficace senza l’incorporamento strutturale del tessuto epatico, che semplifica la procedura di affettatura. Questa tecnica può essere utilizzata anche per creare PCLS da fegati malati, compresi quelli da modelli murini di fibrosi/cirrosi6 e steatosi epatica7.
Oltre a dimostrare le tecniche necessarie per la preparazione e la coltura tissutale di PCLS, questo rapporto esamina anche la fattibilità di questi tessuti ex vivo misurando i livelli di triposfato di adenosina (ATP) ed esaminando l’istologia dei tessuti per valutare la necrosi e la fibrosi. Come procedura sperimentale rappresentativa, pcLS sono trattati con concentrazioni patofisiologiche di tre diversi acidi biliari (glicocolilici, taurocolilici e colici) per simulare lesioni epatiche colestatiche. Nel contesto della lesione epatica colestatica, l’acido taurocholico in particolare ha dimostrato di essere significativamente aumentato sia nel siero che nella bile dei bambini con malattia epatica associata alla fibrosi cistica8.
Le cellule progenitrici del fegato sono state trattate anche in vitro con acido taurocolilico per simulare i livelli elevati di acido taurocolilico osservati nei pazienti, e questo trattamento ha causato una maggiore proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici epatiche verso un fenotipo biliare (cholangiocyte)9. Successivamente, PCLS sono stati trattati ex vivo con elevati livelli di acido taurocolilico, e sono stati osservati marcatori di colgaliociti aumentati. Ciò supporta l’osservazione in vitro che l’acido taurocholico guida la proliferazione biliare e/o la differenziazione nel contesto della malattia epatica associata alla fibrosi cistica pediatrica9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo dimostra l’applicazione dell’isolamento e della coltura dei tessuti del PCLS murino, e le procedure sono progettate per valutare sia la vitalità che l’utilità, nonché per esaminare gli impatti dei mediatori esogeni della patobiologia epatica utilizzando saggi biochimici, istologia e qPCR. L’utilità sperimentale della coltura tissutale PCLS nei roditori e negli esseri umani è stata dimostrata in una vasta gamma di applicazioni, tra cui indagini sperimentali in microRNA15/RNA<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di ricerca del National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell’Australia (Grant No. DA APP1048740 e da APP1142394 a G.A.R.; DA APP1160323 a J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm è supportato da una Senior Research Fellowship del NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo è stato supportato dal programma TALENTO di Madrid, Spagna (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
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