Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática
Summary
Este protocolo fornece um método simples e confiável para a produção de fatias hepáticas de corte de precisão viável de camundongos. As amostras de tecido ex vivo podem ser mantidas condições de cultura de tecidos de laboratório por vários dias, fornecendo um modelo flexível para examinar a patobiologia hepática.
Abstract
Compreender os mecanismos de lesão hepática, fibrose hepática e cirrose que sustentam doenças hepáticas crônicas (ou seja, hepatite viral, doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática metabólica e câncer de fígado) requer manipulação experimental de modelos animais e culturas de células in vitro. Ambas as técnicas possuem limitações, como a exigência de um grande número de animais para manipulação in vivo. No entanto, as culturas celulares in vitro não reproduzem a estrutura e a função do ambiente hepático multicelular. O uso de fatias hepáticas cortadas com precisão é uma técnica na qual fatias uniformes de fígado de rato viável são mantidas na cultura de tecidos de laboratório para manipulação experimental. Essa técnica ocupa um nicho experimental que existe entre estudos em animais e métodos de cultura celular in vitro. O protocolo apresentado descreve um método simples e confiável para isolar e cultivar fatias hepáticas cortadas com precisão de camundongos. Como aplicação desta técnica, as fatias de fígado ex vivo são tratadas com ácidos biliares para simular lesão hepática colestática e, finalmente, avaliar os mecanismos da fibrogênese hepática.
Introduction
A patogênese da maioria das doenças hepáticas crônicas (ou seja, hepatite viral, esteatohepatite não alcoólica, lesão hepática colestática e câncer de fígado) envolve interações complexas entre vários tipos diferentes de células hepáticas que impulsionam inflamação, fibrogênese e desenvolvimento do câncer1,2. Para entender os mecanismos moleculares subjacentes a essas doenças crônicas baseadas no fígado, as interações entre múltiplos tipos de células hepáticas devem ser investigadas. Embora múltiplas linhas de células hepáticas (e, mais recentemente, organóides) possam ser cultivadas in vitro, esses modelos não emulam com precisão a complexa estrutura, função e diversidade celular do microambiente hepático3. Além disso, células hepáticas cultivadas (em particular, linhas celulares transformadas) podem desviar-se de sua biologia de origem original. Modelos animais são usados experimentalmente para investigar as interações entre múltiplos tipos de células hepáticas. No entanto, eles podem se tornar significativamente reduzidos no escopo para manipulação experimental, devido a efeitos significativos fora do alvo em órgãos extrahepáticos (por exemplo, ao testar potenciais terapêuticas).
O uso de fatias hepáticas cortadas com precisão (PCLS) na cultura tecidual é uma técnica experimental usada pela primeira vez em estudos de metabolismo de drogas e toxicidade, e envolve o corte de fatias hepáticas viáveis, ultrafinas (cerca de 100-250 μm de espessura). Isso permite a manipulação experimental direta do tecido hepático ex vivo4. A técnica faz uma ponte entre os estudos em animais in vivo e os métodos de cultura celular in vitro, superando muitas desvantagens de ambos os métodos (ou seja, limites práticos na gama de experimentos que podem ser realizados em animais inteiros, bem como perda de estrutura/função e diversidade celular com métodos de cultura celular in vitro).
Além disso, o PCLS aumenta consideravelmente a capacidade experimental em comparação com estudos em animais inteiros. Como um rato pode produzir mais de 48 fatias de fígado, isso também facilita o uso de grupos de controle e tratamento do mesmo fígado. Além disso, a técnica separa fisicamente o tecido hepático de outros sistemas de órgãos; portanto, remove potenciais efeitos fora do alvo que podem ocorrer em animais inteiros ao testar os efeitos de estímulos exógenos.
Neste protocolo, os PCLS são gerados usando um vibratome com uma lâmina vibratória lateral. Outros estudos têm usado com sucesso um cortador de tecido krumdieck, como descrito em Olinga e Schuppan5. No vibratomo, a vibração lateral da lâmina evita o rasgo do tecido ultrafino causado pelo estresse da cisalhamento, pois a lâmina é empurrada para dentro do tecido. Tanto o vibratome quanto o cortador de tecido krumdieck funcionam efetivamente sem incorporação estrutural de tecido hepático, o que agiliza o procedimento de corte. Esta técnica também pode ser usada para criar PCLS a partir de fígados doentes, incluindo os de modelos de camundongos de fibrose/cirrose6 e esteatose hepática7.
Além de demonstrar as técnicas necessárias para a preparação e cultura tecidual do PCLS, este relatório também examina a viabilidade desses tecidos ex vivos medindo os níveis de tofosfato de adenosina (ATP) e examinando a histologia tecidual para avaliar necrose e fibrose. Como procedimento experimental representativo, os PCLS são tratados com concentrações fisiopatológicas de três ácidos biliares diferentes (ácidos glicólico, taurocholic e célico) para simular lesão hepática colestática. No contexto da lesão hepática colestática, o ácido taurochólico, em particular, mostrou-se significativamente aumentado tanto no soro quanto na bile de crianças com fibrose cística associada à doença hepática8.
As células progenitoras hepáticas também foram tratadas in vitro com ácido taurochólico para simular os níveis elevados de ácido taurochólico observados em pacientes, e este tratamento causou aumento da proliferação e diferenciação das células progenitoras hepáticas em direção a um fenótipo biliar (colangiocito)9. Posteriormente, os PCLS foram tratados ex vivo com níveis elevados de ácido taurochólico, e foram observados marcadores de colangiocito aumentados. Isso suporta a observação in vitro de que o ácido taurochólico impulsiona a proliferação biliar e/ou diferenciação no contexto da doença hepática cística pediátrica9.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo demonstra a aplicação do isolamento murina PCLS e cultura tecidual, e os procedimentos são projetados para avaliar tanto a viabilidade quanto a utilidade, bem como examinar os impactos de mediadores exógenos da patobiologia hepática usando ensaios bioquímicos, histologia e qPCR. A utilidade experimental da cultura de tecidos PCLS em roedores e humanos tem sido demonstrada em uma ampla gama de aplicações, incluindo investigações experimentais em microRNA15/RNA<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa do National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália (Grant No. APP1048740 e APP1142394 para G.A.R.; APP1160323 para J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm é apoiado por uma Bolsa de Pesquisa Sênior do NHMRC da Austrália (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo foi apoiado pelo programa TALENTO de Madrid, Espanha (T1-BIO-1854).
Materials
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
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