축색 수송은 운동 신경 건강을 위한 중요한 기계장치입니다. 이 프로토콜에서 우리는 미세 유체 챔버를 사용하여 운동 뉴런 축축에서 산성 구획및 미토콘드리아의 축산 수송을 추적하기위한 상세한 방법을 제공합니다.
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방법 논문
미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
운동 뉴런 (MN)은 매우 긴 축축을 가진 고도로 편광된 세포입니다. 축 색 수송은 MN 건강에 대 한 중요 한 메커니즘, 신경 성장에 기여, 개발, 그리고 생존. 우리는 MN 축색에 형광 표지된 소기관의 축색 수송을 추적하기 위한 미세 유체 챔버 (MFC)의 사용을 위한 상세한 방법을 기술합니다. 이 방법은 빠르고 비교적 저렴하며 공간과 시간에서 세포내 큐를 모니터링할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 설명한다: 1) 폴리디메틸실록산(PDMS) MFC의 제조; 2) MFC에서 복부 척수 이식 및 MN 해리 배양의 도금; 3) 미토콘드리아 및 산성 구획의 라벨링 과 라이브 공초점 상상력; 4) 수동 및 반자동 축색 수송 분석. 마지막으로, 우리는 HB9::GFP 복부 척수 의 미토콘드리아 및 산성 구획의 수송에 있는 다름을 시스템 타당성의 증거로 축삭을 심출한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 축색 부품의 축색 수송을 연구하기 위한 효율적인 도구와 공간 실험 가능성을 발견하는 데 도움이 되는 MFC 사용에 대한 단순화된 설명서를 제공합니다.
서론
MN은 성인 인간에서 1 미터 까지 도달하는 긴 축색을 가진 높게 편광한 세포입니다. 이러한 현상은 MN 연결 및 기능 유지 관리에 중요한 과제를 만듭니다. 따라서, MN은 세포체에서 시냅스및 뒤로 축세포를 따라 정보, 세포기관 및 물질의 적절한 수송에 의존합니다. 단백질 RNA 및 세포기관과 같은 다양한 세포 성분은 축색을 통해 정기적으로 셔틀됩니다. 미토콘드리아는 MN에서 일상적으로 수송되는 중요한 세포기관입니다.1,2 미토콘드리아의 축색 수송은 잘 연구 된 과정3,,4. 흥미롭게도, 미토콘드리아 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 및 특히 MN질병5에서관련시키기 위하여 보고되었다. 산성 구획은 MN 축색을 따라 움직이는 본질적인 세포기관에 대한 또 다른 예가 됩니다. 산성 구획에는 리소좀, 내인성, 트랜스 골지 장치 및 특정 분비 소포6이포함된다. 산성 구획의 축축한 수송에 있는 결점은 몇몇 신경 퇴행성 질병 에서 뿐만 아니라7에서찾아냈고, 최근....
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프로토콜
이 프로토콜에서 동물의 관리 및 치료는 동물 윤리에 대한 텔 아비브 대학위원회의 감독과 승인하에 수행되었다.
1. MFC 준비
- 1차 금형의 PDMS 주조(그림 1)
- 자세한 프로토콜9에따라 기본 금형(웨이퍼)을 구입하거나 생성합니다.
- 코팅 단계로 진행하기 전에 가압 공기를 사용하여 웨이퍼 플랫폼에서 모든 유형의 먼지를 제거하십시오. 웨이퍼의 표면은 부드럽고 선명하게 보입니다.
- 액체 질소 50 mL로 용기를 채웁니다. 10 mL 주사기와 23G 바늘을 준비합니다.
참고 : 이 단계의 모든 절차는 화학 후드에서 수행해야합니다. - 화학 후드에서 주사기와 바늘을 사용하여 액체 질소 2 mL를 풀링하십시오. 공기가 그려진 것처럼 보일 지 모르지만 주사기는 질소로 채워져 있습니다(그림 1A). 웨이퍼 함유 플레이트를 밀봉 가능한 용기에 놓습니다.
- 스크류는 클로로트리메틸실란 병을 열고 질소로 채워진 주사기를 사용하여 고무 캡을 관통하고 주사기의 전체 내용물 전체를 병....
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결과
기재된 프로토콜에 따라, 마우스 배아 HB9::GFP 척수 이식은 MFC에서 배양하였다(도4A). 축삭이 완전히 말단 구획으로 교차 할 때 이식은 7 일 동안 재배되었다. 미토콘드리아 및 산성 구획에 라벨을 붙이기 위해 미토트래커 딥 레드 및 리소트래커 레드 염료를 말단 및 근위 구획에 첨가하였다(도4C). 말단 홈내의 축삭을 이미지화하고, 영상을 분석하였다: 먼저, 규극물 분석을 이용한 일반적인 이동 분포를 비교하였다(도4B,D). 이 분석은 산성 구획에서만 역행 방향으로 편향을 나타냈다(무이동 = 77.1±9.5%, 역행 = 16.9±8.3%, 전단등급 = 6±5%; ; 도 4
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토론
이 프로토콜에서는 운동 뉴런에서 미토콘드리아 및 산성 구획의 축색 수송을 추적하는 시스템을 설명합니다. 이 단순화된 체외 플랫폼은 세포외 뉴런 구획을 정밀하게 제어, 모니터링 및 조작할 수 있게 해주며, 모터 뉴런 국소 기능을 실험분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 ALS와 같은 MN 질환을 연구하는 데 유용할 수 있으며, 질병10,,16에서축색 수송 기능 장애의 기본 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞출 수 있다. 더욱이, 이 시스템은 또한 영양 인자9,,16,microRNA10,mRNA8,및 건강하고 병에 걸린 MN 또는 감각9 또는 교감 축삭14와같.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF, 561/11)과 유럽 연구 위원회 (ERC, 309377)의 보조금에 의해 지원되었다.
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참고문헌
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neu....
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