वैस्कुलराइजेशन, विस्तारित विकास और बेहतर माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए गुर्दे ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक संस्कृति का अनुकूलन
Summary
यह काम अंग विकास का अध्ययन करने के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है, एवियन भ्रूण से कोरियोएलन्टोइक झिल्ली (कैम) पर एक बेहतर विद्वेष सेटअप जो सुसंस्कृत भ्रूणीय अंगों और ऑर्गनॉइड के संवहनी करण के लिए अनुमति देता है और एक उपन्यास फिक्स्ड जेड-दिशा संशोधित प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अंग संस्कृति विधि जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-चूक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुमति देती है।
Abstract
भ्रूणीय गुर्दे ऑर्गानाटिपिक संस्कृतियां, और विशेष रूप से pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न गुर्दे ऑर्गेनॉइड, विकासात्मक प्रक्रियाओं और मॉडलिंग गुर्दे की बीमारी का पालन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं। हालांकि, मॉडल संवहनी और कार्यक्षमता की कमी से सीमित हैं। इसका समाधान करने के लिए, संवहनी और रक्त प्रवाह की बहाली हासिल करने के लिए एवियन भ्रूण की कोरियोलंट्टोइक झिल्ली (कैम) के लिए कोशिकाओं और ऊतकों को xenografting की विधि के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। ग्राफ्ट कस्टम-निर्मित मिनीजलाशयों के साथ मढ़ा जाता है जो नमूनों को सीएएम में ठीक करते हैं और उन्हें संस्कृति माध्यम के साथ आपूर्ति करते हैं जो ग्राफ्ट को सूखने से बचाता है। बेहतर संस्कृति विधि ज़ेनोग्राफकोस को 9 दिनों तक बढ़ने की अनुमति देती है। पांडुलिपि में पहले से प्रकाशित फिक्स्ड जेड-डायरेक्शन (FiZD) विधि का उपयोग करके गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटाइप संस्कृतियों की दीर्घकालिक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए इष्टतम स्थितियां प्रदान करने का भी वर्णन किया गया है। यह विधि धीरे-धीरे एक बड़ी मात्रा में ग्लास कवरस्लिप और झिल्ली के बीच भ्रूणीय अंग या ऑर्गेनोइड को संकुचित करती है और 12 दिनों तक इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट स्थितियां प्रदान करती है। साथ में, ये विधियां बेहतर कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक गुर्दे की संस्कृतियों को संवहनी और रक्त प्रवाह की अनुमति देती हैं। यहां वर्णित विधियां गुर्दे पूर्व वीवो के मौलिक और लागू कार्यों का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक फायदेमंद हैं। दोनों विधियां विभिन्न प्रकार के ऊतकों और ऑर्गेनॉइड पर लागू होती हैं।
Introduction
भ्रूण गुर्दे की ऑर्गानोटिक संस्कृति दशकों पहले1,2,3. गुर्दे के ऑर्गेनॉइड स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे 4 के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उन्नत मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्वकरतेहैं । हालांकि, दोनों तरीकों के लिए मुख्य दोष यह है कि न तो विधि गुर्दे के मुख्य कार्य को फिर से तैयार करती है: रक्त निस्पंदन। नेफ्रोन और गुर्दे के वास्कुल्चर वैवो विकास में प्रारंभिक चरण के समान गुर्दे के ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोपिक संस्कृतियों में विकसित होते हैं; हालांकि, ग्लोमेरिकुली में गठित विट्रो अवासर5रहते हैं . पूर्व वीवो भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड का संवहनी पहले केवल वीवो स्थितियों में प्रत्यारोपण प्रयोगों में प्रदर्शित किया गया था। उदाहरण के लिए, माउस किडनी कैप्सूल के नीचे मानव pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनॉइड का प्रत्यारोपण ऑर्गेनॉइड में नेफ्रोन के विकास को कार्यात्मक चरण6में जाने की अनुमति देता है।
विशुद्ध रूप से इन विट्रो संस्कृतियों और वीवो प्रत्यारोपण विधियों के बीच एक मध्यवर्ती दृष्टिकोण एवियन भ्रूण के कैम के लिए विद्वेष है। अक्षुण्ण माउस किडनी प्राइमोर्डिया का संवहनी पहले इस प्रणाली7,8का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है । हालांकि, यह भी दिखाया गया कि ज़ेनोट्रांसप्लांट ेड यूरिन किडनी में रेनल वैक्यूलेचर मेजबान एंडोथेलियम से लिया गया था, न कि भ्रष्टाचार9से । इस अवलोकन ने गुर्दे की वैस्कुलचर के विकास का अध्ययन करने के लिए भ्रूणीय गुर्दे के चिमेरिक (एवियन-स्तनधारी) मॉडलकी क्षमता को काफी कम कर दिया, क्योंकि प्रायोगिक स्थितियां दाता-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के अस्तित्व के लिए गैर-अनुमत थीं।
इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में प्रस्तुत एवियन अंडे के कैम पर माउस भ्रूण गुर्दे की खेती के लिए एक बेहतर विधि है, जो ऑर्गानोटिक संस्कृति और विद्वेष की सूक्ष्म पर्यावरणीय स्थितियों का संयोजन है। पिछले तरीकों के लिए मुख्य सुधार यह है कि माउस भ्रूण गुर्दे और गुर्दे ऑर्गेनॉइड सीधे कैम पर रखने के बजाय, प्रत्यारोपण क्षेत्र संस्कृति माध्यम से भरा permeable minireservoirs के साथ मढ़ा है कि प्रत्यारोपित ऊतक की आपूर्ति पोषक तत्वों के साथ और इसे सुखाने से बचाएं। प्रयोगों की सफलता दर काफी बढ़ जाती है और दाता-व्युत्पन्न वास्कुलचर के विकास के लिए स्थितियां सुधर जाती हैं । xenotransplant संस्कृतियों के लिए इस विधि के आवेदन के परिणामस्वरूप ग्लोमर्युलर वास्कुलचर के विकास में दाता गुर्दे से एंडोथेलियल कोशिकाओं शामिल हैं।
सेलुलर मॉर्फोजेनेसिस का विस्तृत विश्लेषण गुर्दे की संस्कृति मॉडल का एक और महत्वपूर्ण अनुप्रयोग है। गुर्दे की संस्कृतियों के समय-चूक छवि अधिग्रहण के पहले सूचित विधियां केवल समग्र आकृति विज्ञान और भ्रूणीय गुर्दे के पैटर्न के विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओंको 10पर नज़र रखने के लिए नहीं। हाल ही में, एक उपन्यास फिक्स्ड जेड-डायरेक्शन (FiZD) विधि उच्च संकल्प conफोकल 3D समय-गुर्दे ऑर्गेनॉइड और ऑर्गानोटिक संस्कृतियों की चूक इमेजिंग के उद्देश्य से11वर्णित किया गया था । इस विधि में, ऑर्गेनोइड और भ्रूणीय अंगों को धीरे-धीरे एक ग्लास कवरस्लिप और कस्टम-डिज़ाइन की गई प्लेट में ट्रांसवेल डालने की पारगम्य झिल्ली के बीच संकुचित किया जाता है जब तक कि नमूने की मोटाई 70 माइक्रोन तक न पहुंच जाए, इमेजिंग के लिए इष्टतम ऑप्टिकल स्थितियां प्रदान नहीं की जाती हैं। तरीकों के दूसरे भाग में, कस्टम-डिज़ाइन की गई प्लेट के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और दीर्घकालिक ऑर्गेनॉइड इमेजिंग के लिए FiZD प्रयोगों का सेटअप वर्णित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
दो विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं जो शास्त्रीय गुर्दे की आर्गानोसाइटिक संस्कृति विधि को परिष्कृत करते हैं, और पूर्व वीवो भ्रूणीय गुर्दे और ऑर्गेनोइड की इमेजिंग संवहनी, विस्तारित विकास और इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सुमेन अकातेमिया (फिनलैंड अकादमी) (206038, 121647, 250900, 260056) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था; सेंटर ऑफ एक्सीलेंस ग्रांट 2012-2017 251314), मुनुइस्सäटिओ – फिनिश किडनी एंड लिवर एसोसिएशन, सिग्रिड जुसेलुकसेन Säätiö, विक्टोरियास्टिफ्टेलसेन, फिनलैंड में स्वीडिश कल्चरल फाउंडेशन, नोवो नॉर्डिस्क, Syöpäjärjestöt (फिनलैंड के कैंसर सोसायटी), यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013; अनुदान FP7-स्वास्थ्य-F5-2012-नवाचार-1 EURenOmics 305608), और H2020 मैरी Sklodowska-Curie कार्रवाई अभिनव प्रशिक्षण नेटवर्क “RENALTRACT” परियोजना 643 लेखक तकनीकी सहायता के लिए पाउला हाइपस, जोहाना केकोलाहटी-लियास और हैनेले हर्कमैन का शुक्रिया अदा करते हैं।
आंकड़े 3, 4, और फिल्म 2 विकाससे अनुमति के साथ फिर से मुद्रित कर रहे हैं ।
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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