Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato
Summary
Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell’organo con condizioni sperimentali modificate che consente l’imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.
Abstract
Le colture organotiche renali embrionali, e in particolare gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti, sono strumenti eccellenti per seguire i processi di sviluppo e modellare la malattia renale. Tuttavia, i modelli sono limitati dalla mancanza di vascolarizzazione e funzionalità. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un protocollo migliorato per il metodo di xenotrapianto di cellule e tessuti alla membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario per ottenere la vascolarizzazione e il ripristino del flusso sanguigno. Gli innesti sono sovrapposti a minicarri su misura che fissano i campioni al CAM e forniscono loro un mezzo di coltura che protegge gli innesti dall’essiccazione. Il metodo di coltura migliorato consente agli xenograforti di crescere fino a 9 giorni. Il manoscritto descrive anche come fornire condizioni ottimali per l’imaging confocale a lungo termine di organoidi renali e colture organotipiche utilizzando il metodo di direzione fissa (Fi-D) pubblicato in precedenza. Questo metodo comprime delicatamente un organo embrionale o organoide tra un coperchio di vetro e la membrana in una grande quantità di mezzo e fornisce ottime condizioni per l’imaging per un massimo di 12 giorni. Insieme, questi metodi consentono la vascolarizzazione e il flusso sanguigno agli organoidi renali e alle colture renali organotipiche con una migliore imaging confocale. I metodi qui descritti sono molto utili per studiare le funzioni fondamentali e applicate dei reni ex vivo. Entrambi i metodi sono applicabili a vari tipi di tessuti e organoidi.
Introduction
La coltura organotipica dei reni embrionali è diventata un modello importante per studiare la nefrogenesi decenni fa1,2,3. Gli organoidi renali rappresentano un sistema modello avanzato per studiare lo sviluppo di reni sani e malati4. Lo svantaggio principale per entrambi i metodi, tuttavia, è che nessuno dei due metodi riassume la funzione principale del rene: la filtrazione del sangue. Nefrosci e vascolatura renale si sviluppano in organoidi renali e culture organotipiche in modo simile alla fase iniziale nello sviluppo vivo; tuttavia, i glomeruli formati in vitro rimangono avascolari5. La vascolarizzazione dei reni embrionali e degli organoidi renali ex vivo è stata precedentemente dimostrata negli esperimenti di trapianto solo in condizioni di vivo. Ad esempio, il trapianto di organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti umane sotto una capsula renale di topo consente lo sviluppo dei nefrodi nell’organoid e uno stadio funzionale6.
Un approccio intermedio tra le colture puramente in vitro e i metodi di trapianto in vivo è lo xenotrapianto alla CAM degli embrioni aviari. La vascolarizzazione della primardia renale di topo intatta è stata dimostrata in precedenza utilizzando questo sistema7,8. Tuttavia, è stato anche dimostrato che la vascolatura renale nel rene murino xenotrapiantato è stata derivata dall’endotelio ospite, non l’innesto9. Questa osservazione ha ridotto significativamente il potenziale dei modelli chimerici (aviari-mammiferi) del rene embrionale per studiare lo sviluppo della vascolatura renale, perché le condizioni sperimentali non erano permissive per la sopravvivenza delle cellule endoteliali derivate dai donatori.
Presentato nella prima parte di questo protocollo è un metodo migliorato per la coltivazione di reni embrionali di topo sul CAM di uova aviarie, combinando condizioni microambientali di coltura organotipica e xenotrapianto. Il principale miglioramento dei metodi precedenti è che invece di posizionare i reni embrionali del topo e gli organoidi renali direttamente sul CAM, l’area di impianto è sovrapposta a miniserbatoi permeabili pieni di mezzo di coltura che forniscono il tessuto trapiantato che fornisce il tessuto trapiantato con sostanze nutritive e proteggerlo dall’essiccazione. Il tasso di successo degli esperimenti aumenta in modo significativo e le condizioni per lo sviluppo della vascolatura derivata dal donatore migliorano. L’applicazione di questo metodo alle colture xenotrapianto comporta lo sviluppo della vascolatura glomerare composta da cellule endogene endogene dei reni donatrici.
L’analisi dettagliata della morfogenesi cellulare è un’altra importante applicazione dei modelli di coltura renale. I metodi precedentemente segnalati per l’acquisizione dell’immagine time-lapse delle colture renali sono sufficienti solo per l’analisi della morfologia complessiva e la modellazione del rene embrionale, ma non per tracciare singole cellule10. Recentemente, è stato descritto un nuovo metodo di risoluzione della direzione a z (Fi-D) destinato all’imaging time-lapse 3D confocale ad alta risoluzione di organoidi renali e colture organotipiche11. In questo metodo, gli organoidi e gli organi embrionali sono delicatamente compressi tra un coperchio di vetro e una membrana permeabile di un inserto transwell in una piastra progettata su misura fino a quando lo spessore del campione raggiunge 70 m, fornendo condizioni ottiche ottimali per l’imaging. Nella seconda parte dei metodi, viene descritto un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piastra su misura e la configurazione di esperimenti Fi-D per l’imaging organoid a lungo termine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vengono presentati due protocolli dettagliati che perfezionano il metodo classico della coltura organotipica renale e consentono la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l’imaging 4D ottimale (ad esempio, immagine e tempo 3D) di reni embrionali e organoidi ex vivo. In questa sezione vengono evidenziati i passaggi critici dei metodi e vengono illustrati i problemi.
La differenza significativa tra altri metodi di coltura CAM e questo metodo di coltura CAM del pollo migliorato è l’uso di minis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Suomen Akatemia (Accademia di Finlandia) (206038, 121647, 250900, 260056; Sovvenzione del Centro di Eccellenza 2012-2017 251314, Munuaiss, – Associazione finlandese del rene e del fegato, la Sigrid Juseliuksen S’ti, Victoriastiftelsen, La Fondazione Culturale Svedese in Finlandia, Novo Nordisk, (Società oncologica della Finlandia), il settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013; concedere FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Actions Training Network “RENALTRACT” Project ID 642937. Gli autori ringraziano Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Horkman per assistenza tecnica.
Le figure 3, 4 e Film 2 vengono ristampate con il permesso di Sviluppo.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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