이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.
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방법 논문
혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
배아 성 신장 organotypic 문화, 특히 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드는 발달 과정을 따르고 신장 질환을 모델링하기위한 훌륭한 도구입니다. 그러나, 모델은 혈관화 및 기능의 부족에 의해 제한된다. 이를 해결하기 위해, 조류 배아의 융모란투막(CAM)에 세포 및 조직을 이식하는 방법에 대한 개선된 프로토콜이 개발되어 혈관을 혈관화하고 혈류의 회복을 얻었다. 접목은 샘플을 CAM에 고정하고 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지를 공급하는 맞춤형 미니 저장소로 오버레이됩니다. 개선된 배양 방법은 이종이식을 최대 9일 동안 자랄 수 있게 합니다. 원고는 또한 이전에 간행된 고정 Z 방향 (FiZD) 방법을 사용하여 신장 오르가노이드 및 orgnotnotypic 문화의 장기 공초점 화상 진찰을 위한 최적 조건을 제공하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 유리 커버슬립과 멤브레인 사이에 배아 장기 또는 오르가노이드를 다량의 배지로 부드럽게 압축하고 최대 12일 동안 이미징을 위한 우수한 조건을 제공합니다. 함께, 이 방법은 향상한 공초점 화상 진찰을 가진 신장 오르가노이드 및 organotypic 신장 문화에 혈관화 그리고 혈류량을 허용합니다. 여기에 설명 된 방법은 생체 내 신장의 기본 및 적용 기능을 연구하는 데 매우 유용합니다. 두 방법 모두 다양한 유형의 조직 및 오르가노이드에 적용 가능합니다.
서론
배아 신장의 오르가노티픽 배양은 수십 년 전신발생을연구하는 중요한 모델이 되었다1,2,,3. 신장 오르가노이드는 건강하고 병에 걸린 신장의 발달을 연구하기위한 고급 모델 시스템을 나타냅니다4. 그러나 두 방법의 주요 단점은 두 방법 모두 신장의 주요 기능인 혈액 여과를 다시 요약하지 않는다는 것입니다. 네프론과 신장 혈관 구조는 생체 내 발달의 초기 단계와 유사하게 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화에서 개발; 그러나, 시험관내에서 형성된 사구체는 avascular5. 생체내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 혈관화는 생체내 조건 하에서만 이식 실험에서 이전에 입증되었다. 예를 들어, 마우스 신장 캡슐 하에 인간 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드의 이식은 기능적 단계6에오르가노이드에서 네프론의 발달을 허용한다.
순전히 생체외 배양과 생체 내 이식 방법 사이의 중간 접근법은 조류 배아의 CAM에 대한 이종이식이다. 그대로 마우스 신장....
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프로토콜
동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 사용을위한 핀란드 의 국가 법률, 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약 (ETS 123), EU 지침 86/609 / EEC에 따라 시행되었습니다.
1. 닭 CAM에 마우스 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 재배를위한 미니 저수지의 제조 및 이종이식 실험을 설정
- 6웰 또는 12웰 플레이트용으로 설계된 트랜스웰 세포 배양 인서트를 사용하십시오.
참고: 특정 실험에 따라 크거나 작은 미니 저장소를 사용할 수 있습니다. 최대 8개의 배아 신장을 이식하거나 동일한 닭 배아에 여러 개의 미니 저장소를 놓을 때(예: 동일한 닭 CAM에서 실험 및 대조군 샘플을) 작은 미니 저장소를 사용하는 것이 가장 좋습니다. - 원형 톱날 또는 핸드 톱이 달린 회전식 멀티툴을 사용하여 인서트 의 측면을 잘라내어 투과성 멤브레인이 부착된 2mm 높이의 플라스틱 링을 만듭니다.
- 메스 나 날카로운 칼로이 미니 저수지의 가장자리를 연마.
- 미니 저장소를 70% 에탄올로 1시간 이상 살균합니다.
- 미니 저수지를 오토클레이브 이중 증류수로 세척하고 층상 후드에서 건조시키십시오.
- PBS 및 배양 매체 (고혈....
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결과
여기에 제시된 CAM 배양 프로토콜은 닭 CAM에 대한 이종이식의 결과로 신장 오르가노이드 및 배아 신장의 고효율 혈관을 가능하게하였다(그림 1, 영화 1). 배양 배지를 함유한 미니저수지는 기증자 조직에 영양분을 공급하고 적절한 혈관을 지정하기 전의 기간 동안 건조로부터 보호하였다. 이 방법은 기증자 유래 내피 세포가 성장하기 위한 관대한 조건을 제공했다. 따라서, 이식된 신장 및 오르가노이드에서 신장 혈관구조는 주로, 전적으로는 아니지만, 공여자 특이적 세포에 의해나타났다(도 2B,C,F). 더 성숙한 사구체 혈관구조는 신장 오르골형 배양보다 CAM에 이식된 신장 및 신장 오르가노이드에서 수득되었다(도2D,E).
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토론
2개의 상세한 프로토콜은 고전적인 신장 organotypic 문화 방법을 구체화하고, 전 생체 내 배아 신장 및 오르가노이드의 혈관 세포화, 확장된 발달 및 최적 4D (즉, 3D 심상 및 시간) 화상 진찰을 가능하게 합니다 제시됩니다. 이 섹션에서는 메서드의 중요한 단계를 중대하고 문제 해결에 대해 설명합니다.
다른 CAM 배양 방법과 이 개선된 치킨 CAM 배양 방법의 유의한 차이점은 CAM에 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 이종이식에서 맞춤형 미니저장소를 사용하는 것입니다. 수정된 트랜스웰 삽입의 멤브레인 바닥은 닭 CAM에 대한 샘플을 누르고 제자리에 유지합니다. 인서트의 측면은 접목을 건조로부터 보호하는 배양 배지의 저장소 역할을 합니다. 이 방법은 미니저장소를 배치할 수 있는 CAM의 더 큰 영역을 노출시키고 혈관화과정(12,,13)을시각적으로 쉽게 따를 수 있도.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 수오멘 아카테미아 (핀란드 아카데미)에 의해 재정적으로 지원되었다 (206038, 121647, 250900, 260056; 우수 교부금 센터 2012-2017 251314), Munuaissätiö - 핀란드 신장 및 간 협회, 시그리드 주셀리우크센 Sätiö, 빅토리아스티프텔센, 핀란드의 스웨덴 문화 재단, 노보 노디스크, Syöpäjärjestöt (핀란드 암 학회), 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-혁신-1 EURenOmics 305608), 및 H2020 마리 Sklodowska-Curie 혁신적인 행동 "6" RE2. 저자는 파울라 하이퍼스, 요한나 케콜라티-리아스, 하넬 레크만에게 기술 지원을 해주셔서 감사합니다.
그림 3, 4 및 무비 2는 개발의허가를 받아 재인쇄됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조정 가능한 스페이드 드릴 비트 | Bosch | 2609255277 | 직경 20mm 구멍 드릴링용 |
| 자동 에그 터너 | OLBA B.V., 네덜란드 | AT-42 | 전 OVO 설정 전 알의 부화용. |
| 세포 인큐베이터 | Panasonic | 13090543 | 온도는 37°C로 설정되었습니다. C, 90% 습도, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM 배양 인큐베이터. 온도는 37°C로 설정되었습니다. C, 습도 90%, CO2 |
| Cellstar 6웰 플레이트 | Greiner | M9062 | 인서트와 일치하는 16mm 웰 깊이 |
| Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell 다중 웰 플레이트(투과성 폴리카보네이트 멤브레인 인서트 포함) | Corning | 10301031 | 6웰 플레이트용. 40 & 마이크로; m 기공 크기 |
| 카운터 싱크 드릴 비트 | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | 연마 용 (20.5mm, 1/4 ", HSS) |
| 일회용 유리 모세관 | Blaubrand | 7087 33 | |
| 일회용 메스 | Swann-Morton | 0501 | |
| 해부 현미경 | Olympus | SZ61 | |
| 드릴링 머신 | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | 고포도 |
| 난자 인큐베이터 컴팩트 S84 | Grumbach, Germany | 8012 | ex ovo setup 전 난자 배양용. 온도는 38°C로 설정되었습니다. 상대 습도가 60% 이상으로 설정된 C |
| 에탄올(70%) | VWR | ||
| 수정란 | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 Dumont | #5SF | ||
| Glass Coverslips | Menzel-GlÄ ser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| 무대 위 인큐베이터 | Okolab | Boldline, 맞춤 제작 | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | 미니 저수지 세척. |
| 페니실린 및 스트렙토마이신 | 시그마 | P4333 | |
| 폴리스티렌 비즈 | 코퍼스큘러 | 1000263-10 | 70 &마이크로; 직경 m |
| 로터리 멀티 툴 시스템 | Dremel | 4000 | |
| 납땜 인두 | 웰러 | TCP S | 가열 유리 모세관도 사용할 수 있습니다 |
| Thincert 12 웰 세포 배양 인서트 0.4 µ m-pore 폴리스티렌 멤브레인 | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well 세포 배양 인서트 0.4 µ m-pore 폴리스티렌 멤브레인 | Greiner Bio-One | 657610 |
참고문헌
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Nat....
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재인쇄 및 허가
