Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada
Summary
Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.
Abstract
Culturas organotípicas de rim embrionário, e especialmente organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes, são excelentes ferramentas para acompanhar processos de desenvolvimento e modelar doenças renais. No entanto, os modelos são limitados pela falta de vascularização e funcionalidade. Para lidar com isso, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para o método de xenoenxerto de células e tecidos para a membrana corioallantoica (CAM) de um embrião aviário para obter vascularização e restauração do fluxo sanguíneo. Os enxertos são sobrepostos com minireservatórios feitos medida que fixam as amostras no CAM e fornecem-lhes meio de cultura que protege os enxertos da secagem. O método de cultura aprimorado permite que os xenoenxertos cresçam por até 9 dias. O manuscrito também descreve como fornecer condições ideais para imagens confocais de longo prazo de organóides renais e culturas organotípicas usando o método Fixa Z-Direction (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente um órgão embrionário ou organóide entre um deslizamento de vidro e membrana em uma grande quantidade de meio e fornece excelentes condições para a imagem por até 12 dias. Juntos, esses métodos permitem a vascularização e o fluxo sanguíneo para organóides renais e culturas renais organotípicas com melhor imagem confocal. Os métodos descritos aqui são altamente benéficos para o estudo de funções fundamentais e aplicadas de rins ex vivo. Ambos os métodos são aplicáveis a vários tipos de tecidos e organóides.
Introduction
A cultura organotípica dos rins embrionários tornou-se um importante modelo para estudar a nefrogênese décadas atrás1,2,3. Organóides renais representam um sistema de modelo avançado para estudar o desenvolvimento de rins saudáveis e doentes4. A principal desvantagem para ambos os métodos, no entanto, é que nenhum dos métodos recapitula a função principal do rim: filtração sanguínea. Neffros e vasculatura renal desenvolvem-se em organóides renais e culturas organotípicas de forma semelhante ao estágio inicial no desenvolvimento vivo; no entanto, os glomeruli formados in vitro permanecemavasculares 5. A vascularização de rins embrionários ex vivos e organóides renais foi previamente demonstrada em experimentos de transplante apenas em condições in vivo. Por exemplo, o transplante de organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes humanas sob uma cápsula de rim de camundongos permite o desenvolvimento dos néfrons no organóide para um estágio funcional6.
Uma abordagem intermediária entre culturas puramente in vitro e métodos de transplante in vivo é o xenotransplante para a CAM de embriões aviários. A vascularização da primordia renal do rato intacta foi demonstrada anteriormente usando este sistema7,8. No entanto, também foi demonstrado que a vasculatura renal no rim murina xenotransplantado foi derivada do endotélio hospedeiro, não do enxerto9. Esta observação reduziu significativamente o potencial de modelos quiméricos (aviários-mamíferos) de rim embrionário para estudar o desenvolvimento da vasculatura renal, porque as condições experimentais não eram permissivas para a sobrevivência de células endoteliais derivadas de doadores.
Apresentado na primeira parte deste protocolo é um método aprimorado para o cultivo de rins embrionários de camundongos em CAM de ovos aviários, combinando condições microambientais de cultura organotípica e xenotransplante. A principal melhoria dos métodos anteriores é que, em vez de colocar os rins embrionários do rato e organóides renais diretamente no CAM, a área de implantação é sobreposta com minireservatórios permeáveis cheios de meio de cultura que fornecem o tecido transplantado com nutrientes e protegê-lo da secagem. A taxa de sucesso dos experimentos aumenta significativamente e as condições para o desenvolvimento da vasculatura derivada de doadores melhoram. A aplicação deste método às culturas xenotransplanteresulta no desenvolvimento da vasculatura glomerular composta por células endógenas endógenas dos rins doadores.
A análise detalhada da morfogênese celular é outra importante aplicação de modelos de cultura renal. Os métodos previamente relatados de aquisição de imagens de lapso de tempo de culturas renais são suficientes apenas para análise da morfologia geral e padronização do rim embrionário, mas não para o rastreamento de células individuais10. Recentemente, foi descrito um novo método Fixo de Direção Z (FiZD) destinado à imagem confocal de lapso de tempo 3D de alta resolução de organóides renais e culturas organotípicas11. Neste método, os organóides e órgãos embrionários são suavemente comprimidos entre uma tampa de vidro e uma membrana permeável de uma inserção transwell em uma placa projetada medida até que a espessura da amostra atinja 70 μm, proporcionando condições ópticas ideais para a imagem. Na segunda parte dos métodos, é descrito um protocolo detalhado para a fabricação de uma placa projetada medida e a configuração de experimentos FiZD para imagens organóides de longo prazo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dois protocolos detalhados são apresentados que refinam o método clássico de cultura organotípica renal, e permitem a vascularização, o desenvolvimento prolongado e a imagem 4D ideal (ou seja, imagem 3D e tempo) de imagens ex vivos embrionárias e organóides. Esta seção destaca as etapas críticas nos métodos e discute a solução de problemas.
A diferença significativa entre outros métodos de cultura CAM e este método de cultura cam de frango melhorado é o uso de minireservatór…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Suomen Akatemia (Academia da Finlândia) (206038, 121647, 250900, 260056; Doação do Centro de Excelência 2012-2017 251314), Munuaissäätiö – Associação Finlandesa de Rim e Fígado, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Fundação Cultural Sueca na Finlândia, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Cancer Society of Finland), o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013; subvenção FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network “RENALTRACT” Project ID 642937 Os autores agradecem a Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Härkman pela assistência técnica.
As figuras 3, 4 e Filme 2 são reimpressas com permissão do Desenvolvimento.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
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