Оптимизация почечной органоидной и органотипической культуры для васкуляризации, расширенного развития и улучшенной микроскопии
Summary
Эта работа описывает два метода для изучения развития органов, улучшенная установка ксенотрансплантации на хориоаллантоической мембране (CAM) из птичьих эмбрионов, что позволяет васкуляризировать культивированные эмбриональные органы и органоиды и новый фиксированный z-направление метод культуры органов с измененными экспериментальными условиями, который позволяет с высоким разрешением замедленной конфокальной визуализации.
Abstract
Эмбриональные почечные органотипические культуры, и особенно плюрипотентные органоиды почек, полученные из стволовых клеток, являются отличными инструментами для следующих процессов развития и моделирования заболеваний почек. Однако модели ограничены отсутствием васкуляризации и функциональности. Для решения этой проблемы был разработан усовершенствованный протокол для метода ксенотрансплантации клеток и тканей к хориоаллантоической мембране (CAM) птичьего эмбриона для получения васкуляризации и восстановления кровотока. Прививки накладываются на заказ мини-водохранилища, которые фиксируют образцы CAM и поставляют их с культурой среды, которая защищает трансплантаты от сушки. Улучшенный метод культуры позволяет ксенотрансвтатам расти до 9 дней. В рукописи также описывается, как обеспечить оптимальные условия для долгосрочной конфокальной визуализации почечных органоидов и органотипических культур с использованием ранее опубликованного метода Fixed -Direction (ФИЗД). Этот метод мягко сжимает эмбриональный орган или органоид между стеклянным крышкой и мембраной в большом количестве среды и обеспечивает отличные условия для визуализации на срок до 12 дней. Вместе эти методы позволяют васкуляризации и приток крови к почечной органоидов и органотипических культур почек с улучшенной конфокальной визуализации. Описанные здесь методы очень полезны для изучения фундаментальных и прикладных функций почек ex vivo. Оба метода применимы к различным типам тканей и органоидов.
Introduction
Органотипическая культура эмбриональных почек стала важной моделью для изучения нефрогенеза десятилетия назад1,,2,,3. Почечные органоиды представляют собой передовую модельсистему для изучения развития здоровых и больных почек4. Основным недостатком обоих методов, однако, является то, что ни один метод не переоценивает основную функцию почек: фильтрацию крови. Нефроны и почечные сосуды развиваются в почечных органоидах и органотипических культурах подобно ранней стадии развития виво; однако, glomeruli формируется в пробирке остаются сосудистые5. Васкуляризация эмбриональных почек ex vivo и почечных органоидов ранее была продемонстрирована в экспериментах по трансплантации только в условиях in vivo. Например, трансплантация плюрипотентных стволовых клеток человека полученных почечных органоидов под капсулой мышиной почки позволяет развитие нефронов в органоидов к функциональной стадии6.
Промежуточный подход между чисто культурами in vitro и методами трансплантации in vivo – это ксенотрансплантация к CAM птичьих эмбрионов. Васкуляризация нетронутой мышиной почки примордии была продемонстрирована ранее с помощью этой системы7,,8. Тем не менее, было также показано, что почечные сосуды в ксенотрансплантации морин почки был получен из принимающей эндотелия, а не трансплантат9. Это наблюдение значительно снизило потенциал химерных (авиано-млекопитающих) моделей эмбриональных почек для изучения развития почечной сосуды, поскольку экспериментальные условия были недопустимыми для выживания эндотелиальных клеток, полученных донорами.
В первой части этого протокола представлен усовершенствованный метод выращивания эмбриональных почек мыши на CAM из птичьих яиц, сочетающий микроэкологические условия орханотипической культуры и ксенотрансплантации. Основное улучшение по сравнению с предыдущими методами заключается в том, что вместо размещения мыши эмбриональных почек и почечных органоидов непосредственно на CAM, область имплантации накладывается проницаемыми минивоилидами, заполненными культурой среды, которые поставляют пересаженную ткань с питательными веществами и защитить его от высыхания. Успешность экспериментов значительно возрастает, а условия для развития сосуд, полученных донорами, улучшаются. Применение этого метода ксенотрансплантационным культурам приводит к развитию гломерулярной сосуды, состоящей из эндогенных эндотелиальных клеток донорских почек.
Детальный анализ клеточного морфогенеза является еще одним важным применением моделей культуры почек. Ранее сообщенные методы замедленного получения изображений культур почек достаточны только для анализа общей морфологии и узорства эмбриональных почек, но не для отслеживания отдельных клеток10. Недавно былописанновый метод Fixed-Direction (ФИЗД), направленный на высокое разрешение конфокальной 3D-замедленной визуализации почечных органоидов и органотипических культур. В этом методе органоиды и эмбриональные органы аккуратно сжимаются между стеклянным покрытием и проницаемой мембраной вставки трансвелл в специально разработанной пластине до тех пор, пока толщина образца не достигнет 70 мкм, обеспечивая оптимальные оптические условия для визуализации. Во второй части методов описан подробный протокол для изготовления специально разработанной пластины и настройки экспериментов по физподготовке для долгосрочного органоидного изображения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представлены два подробных протокола, которые усовершенствуют классический метод почечной арганотипической культуры и позволяют васкуляризировать, расширенное развитие и оптимальное 4D-изображение и время изображения эмбриональных почек и органоидов. В этом разделе освещаются крит…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансово Suomen Akatemia (Академия Финляндии) (206038, 121647, 250900, 260056; Грант Центра Передового Опыта 2012-2017 251314), Мунуаиссютич – Финская ассоциация почек и печени, Сигрид Джуселиуксен Сютио, Викториастифтельсен, Шведский культурный фонд в Финляндии, Ново Нордиск, Сюпейярхештет (Онкологическое общество Финляндии), Седьмая рамочная программа Европейского сообщества (FP7/2007-2013; грант FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) и H2020 Мари Склодов-Кюри Инновационная сеть Авторы благодарят Паулу Хайпус, Джоанну Кеколахти-Лияс и Ханнеле Хёркман за техническую помощь.
Цифры 3, 4 и Movie 2 перепечатываются с разрешения разработки.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. 발생학. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
