Optimering av renal organoid och organotypisk kultur för vascularization, utökad utveckling och förbättrad mikroskopi Imaging
Summary
Detta arbete beskriver två metoder för att studera organutveckling, en förbättrad xenotransplantation setup på chorioallantoic membran (CAM) från aviära embryon som möjliggör vascularization av odlade embryonala organ och organoider och en ny fast z-riktning organodlingsmetod med modifierade experimentella tillstånd som möjliggör högupplösning av time-lapse confocal imaging.
Abstract
Embryonala njurorganotypiska kulturer, och särskilt pluripotenta stamceller-härledda njurorganoider, är utmärkta verktyg för att följa utvecklingsprocesser och modellering njursjukdom. Modellerna begränsas dock av brist på vascularization och funktionalitet. För att ta itu med detta utvecklades ett förbättrat protokoll för metoden för xenografting celler och vävnader till chorioallantoic membranet (CAM) av en aviär embryo att få vascularization och restaurering av blodflödet utvecklats. Transplantaten är överlagrad med skräddarsydda minireservoirs som fixar proverna till CAM och förser dem med odlingsmedium som skyddar ympkvistarna från torkning. Den förbättrade odlingsmetoden gör att xenografts kan växa i upp till 9 dagar. Manuskriptet beskriver också hur man ger optimala förutsättningar för långsiktig konfokal avbildning av njurorganoider och organotypiska kulturer med hjälp av den tidigare publicerade Metoden Fixed Z-Direction (FiZD). Denna metod komprimerar försiktigt ett embryonalt organ eller organoid mellan ett glasöverdrag och membran i en stor mängd medium och ger utmärkta förutsättningar för avbildning i upp till 12 dagar. Tillsammans tillåter dessa metoder vascularization och blodflödet till njurorganoider och organotypiska njurkulturer med förbättrad confocal imaging. De metoder som beskrivs här är mycket fördelaktigt för att studera grundläggande och tillämpade funktioner i njurarna ex vivo. Båda metoderna är tillämpliga på olika typer av vävnader och organoider.
Introduction
Organotypic kultur av embryonala njurar blev en viktig modell för att studera nephrogenesis decennier sedan1,2,3. Njurorganoider utgör ett avancerat modellsystem för att studera utveckling av friska och sjuka njurar4. Den största nackdelen för båda metoderna är dock att ingen metod rekapitulerar njurens huvudsakliga funktion: blodfiltrering. Nefroner och njurvaskulatur utvecklas i njurorganoider och organotypiska kulturer på samma sätt som tidig utveckling av in vivo; den glomeruli som bildas in vitro förblir dock avascular5. Vascularization av ex vivo embryonala njurar och njurmedicinska organoider har tidigare visats i transplantation experiment endast under in vivo villkor. Till exempel, transplantation av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda njurorganoider under en mus njure kapsel möjliggör utveckling av nefroner i organoid till ett funktionellt stadium6.
En mellanliggande metod mellan rent in vitro-kulturer och in vivo transplantationsmetoder är xenotransplantation till CAM av fågelembryon. Vascularization av intakt mus njure primordia har visats tidigare med hjälp av detta system7,8. Det visades dock också att den njurmedicinska vaskulaturen i den xenotransplanterade murinjuren härleddes från värdetotelet, inte transplantatet9. Denna observation minskade avsevärt potentialen hos chimär (avi-däggdjur) modeller av embryonala njurar för att studera utvecklingen av njurmedicinska vasculature, eftersom de experimentella villkoren var icke-vilseledande för överlevnaden av givaren-härledda endotelceller.
Presenteras i den första delen av detta protokoll är en förbättrad metod för odling av mus embryonala njurar på CAM av fågelägg, som kombinerar mikromiljöförhållanden organotypic kultur och xenotransplantation. Den största förbättringen av tidigare metoder är att istället för att placera musen embryonala njurar och njurorganoider direkt på CAM, implantation området är överlagrad med permeabla minireservoirs fyllda med odlingsmedium som levererar den transplanterade vävnaden med näringsämnen och skydda den från torkning. Försökens framgång ökar avsevärt och förutsättningarna för utveckling av givarens vaskulatur förbättras. Tillämpning av denna metod till xenotransplant kulturer resulterar i utvecklingen av glomerular vasculature består av endogena endotel celler från givaren njurar.
Detaljerad analys av cellulär morfogenesis är en annan viktig tillämpning av njurkultur modeller. Tidigare rapporterade metoder för time-lapse bild förvärv av njurkulturer är tillräckliga endast för analys av övergripande morfologi och mönster av embryonala njurar, men inte för att spåra enskilda celler10. Nyligen beskrevs en ny fast Z-Direction (FiZD) metod som syftar till hög upplösning confocal 3D time-lapse imaging av njurorganoider och organotypiska kulturer11. I denna metod komprimeras organoiderna och embryonala organen försiktigt mellan ett glasskydd och ett genomsläppligt membran i ett transwellskär i en specialdesignad platta tills provets tjocklek når 70 μm, vilket ger optimala optiska förhållanden för avbildning. I den andra delen av metoderna beskrivs ett detaljerat protokoll för tillverkning av en specialdesignad platta och installationen av FiZD-experiment för långsiktig organoidavbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Två detaljerade protokoll presenteras som förfina den klassiska njurmedicinska organotypic kultur metod och möjliggöra vascularization, utökad utveckling och optimal 4D (dvs. 3D-bild och tid) bildframställning av ex vivo embryonala njurar och organoider. I det här avsnittet beskrivs de kritiska stegen i metoderna och felsökningen beskrivs.
Den betydande skillnaden mellan andra CAM kultur metoder och denna förbättrade kyckling CAM kultur metod är användningen av skräddarsydda minir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Suomen-ankatemi (Finlands Akademi) (206038, 121647, 250900, 260056; Kompetenscentrum 2012-2017 251314), Munuaissäätiö – Finska Njur- och leverföreningen, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Finlands Kulturstiftelsen, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlands cancersällskap), Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013; bevilja FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) och H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network “RENALTRACT” Project ID 642937. Författarna tackar Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias och Hannele Härkman för tekniskt stöd.
Figurerna 3, 4 och Film 2 skrivs om med tillstånd från Development.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
