Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu
Summary
Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.
Abstract
Embriyonik böbrek organotipik kültürler, ve özellikle pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidler, gelişimsel süreçleri takip etmek ve böbrek hastalığı modelleme için mükemmel araçlardır. Ancak, modeller vaskülarizasyon ve işlevsellik eksikliği ile sınırlıdır. Bunu gidermek için, bir kuş embriyosundaki koryoallantoik membrana (CAM) ksenogreftleme yöntemi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş tir. Greftler, örnekleri CAM’a sabitleyen ve greftleri kurumaya karşı koruyan kültür ortamı sağlayan özel yapım minirezervuarlarla kaplanır. Geliştirilmiş kültür yöntemi ksenogreftlerin 9 güne kadar büyümesini sağlar. El yazması ayrıca, daha önce yayınlanmış Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemini kullanarak renal organoidlerin ve organotipik kültürlerin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulların nasıl sağlandığını da açıklamaktadır. Bu yöntem, embriyonik bir organı veya organoidi cam bir kapak kayması ile membran arasında büyük miktarda orta derecede sıkıştırır ve 12 güne kadar görüntüleme için mükemmel koşullar sağlar. Birlikte, bu yöntemler geliştirilmiş konfokal görüntüleme ile renal organoidler ve organotipik böbrek kültürleri vaskülarizasyon ve kan akışını sağlar. Burada açıklanan yöntemler böbreklerin temel ve uygulamalı fonksiyonlarını incelemek için son derece yararlıdır ex vivo. Her iki yöntem doku ve organoidler çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Embriyonik böbreklerin organotipik kültür on yıllar önce nefrogenez çalışma için önemli bir model oldu1,2,3. Böbrek organoidleri sağlıklı ve hastalıklı böbreklerin gelişimini incelemek için gelişmiş bir model sistemi temsil4. Ancak her iki yöntemin de ana dezavantajı, her iki yöntemin de böbreğin ana işlevini yeniden özetlemesidir: kan filtrasyonu. Nefronlar ve renal vaskülatür renal organoidlerde ve organotipik kültürlerde gelişimin erken evresine benzer şekilde gelişir; ancak, in vitro oluşan glomeruli avaskülerkalır 5. Ex vivo embriyonik böbreklerin ve renal organoidlerin vaskülarizasyonu daha önce sadece in vivo koşullarda yapılan transplantasyon deneylerinde gösterilmiştir. Örneğin, bir fare böbrek kapsülü altında insan pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidlerinin nakli fonksiyonel bir evre6organoid nefron gelişimini sağlar.
Tamamen in vitro kültürler ile in vivo transplantasyon yöntemleri arasında ara yaklaşım, kuş embriyolarının CAM’ine ksenotransplantasyondur. Bozulmamış fare böbrek primordia vaskülarizasyonu daha önce bu sistem kullanılarak gösterilmiştir7,8. Bununla birlikte, ksenonakledilen murine böbrekteki renal vaskülatürin greft9’dandeğil, konak endotelden türetildiği gösterilmiştir. Bu gözlem, embriyonik böbrek modellerinin böbrek vaskülatürgelişimini inceleme potansiyelini önemli ölçüde azaltmıştır, çünkü deneysel koşullar donör kaynaklı endotel hücrelerinin hayatta kalması için müsamaha kariyetsizdir.
Bu protokolün ilk bölümünde sunulan kuş yumurtalarının CAM fare embriyonik böbreklerin ekimi için geliştirilmiş bir yöntemdir, organotipik kültür ve knenotransplantasyon mikroçevre koşulları birleştirerek. Önceki yöntemlerde en önemli gelişme, fare embriyonik böbrekleri ve böbrek organoidlerini doğrudan CAM’e yerleştirmek yerine, implantasyon alanının nakledilen dokuyu besleyen kültür ortamıyla dolu geçirilebilir minirezervuarlarla kaplanmasıdır. besinlerle kuruyup kurutularak korur. Deneylerin başarı oranı önemli ölçüde artar ve donör kaynaklı vaskülatür gelişimi için koşullar geliştirmek. Bu yöntemin ksenotransplant kültürlerine uygulanması, donör böbreklerden endojen endotel hücrelerinden oluşan glomerüler vaskülatür gelişimini ile sonuçlanmaktadır.
Hücresel morfogenezin detaylı analizi böbrek kültürü modellerinin bir diğer önemli uygulamasıdır. Böbrek kültürlerinin zaman atlamalı görüntü edinimi daha önce bildirilen yöntemler sadece genel morfolojisi ve embriyonik böbrek desenleme analizi için yeterlidir, ancak tek tek hücreleri izlemek için10. Son zamanlarda böbrek organoidlerinin ve organotipik kültürlerin yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntülemesini amaçlayan yeni bir Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemi tanımlanmıştır11. Bu yöntemde, organoidler ve embriyonik organlar, numunenin kalınlığı 70 μm’ye ulaşana kadar cam bir kapak kayması ile transwell insertin geçirilebilir bir zarı arasında hafifçe sıkıştırılır ve görüntüleme için en uygun optik koşulları sağlar. Yöntemlerin ikinci bölümünde, özel olarak tasarlanmış bir plakanın imalatı ve uzun süreli organoid görüntüleme için FiZD deneylerinin kurulumu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klasik renal organotipik kültür yöntemini hassaslaştıran, vaskülarizasyon, uzlaşı gelişimi ve ex vivo embriyonik böbreklerin ve organoidlerin optimal 4D (yani 3D görüntü ve zaman) görüntülemesini sağlayan iki ayrıntılı protokol sunulmuştur. Bu bölümde yöntemlerdeki kritik adımlar vurgulanır ve sorun giderme konuları anlatılmaktadır.
Diğer CAM kültür yöntemleri ve bu gelişmiş tavuk CAM kültür yöntemi arasındaki önemli fark CAM embriyonik böbrekler ve bö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Suomen Akatemia (Finlandiya Akademisi) (206038, 121647, 250900, 260056) tarafından finansal olarak desteklenmiştir; Mükemmellik Merkezi hibe 2012-201314), Munuaissäätiö – Finlandiya Böbrek ve Karaciğer Derneği, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Finlandiya İsveç Kültür Vakfı, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlandiya Kanser Derneği), Avrupa Topluluğu’nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) ve H2020 Marie Sklodow-Curie Innovative Training Network “RENALTRACT” Project ID 642997. Yazarlar teknik yardım için Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias ve Hannele Härkman teşekkür ederiz.
Şekil 3, 4 ve Film 2 Geliştirmeizni ile yeniden yazdırılır.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
