बाधा आधारित वास्तविक समय कैंसर सेल प्रवास और आक्रमण के माप
Summary
कैंसर विभिन्न अंगों को मेटास्टेसाइज करने की क्षमता के कारण घातक बीमारी है। विभिन्न उपचार शर्तों के तहत माइग्रेट और आक्रमण करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण चिकित्सकीय रणनीतियों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल ग्लियोब्लास्टोमा कैंसर सेल लाइन की वास्तविक समय की मेटास्टैटिक क्षमताओं का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
कैंसर आनुवंशिक अस्थिरता, उत्परिवर्तन, और पर्यावरण और अन्य तनाव कारकों द्वारा शुरू की कोशिकाओं के अनियंत्रित प्रसार के कारण उत्पन्न होता है। जटिल, बहुस्तरीय आणविक सिग्नलिंग नेटवर्क में ये असामान्यताओं का अधिग्रहण करते हैं, जो दूर के अंगों के लिए अद्यतित कोशिका प्रसार और अस्तित्व, बाह्य मैट्रिक्स क्षरण और मेटास्टेसिस को प्रेरित करते हैं। कैंसर से होने वाली लगभग 90% मौतें मेटास्टैटिक प्रसार के प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभावों के कारण होने का अनुमान है। इसलिए, आनुवंशिक और पर्यावरणीय जोड़तोड़ पर कैंसर सेल व्यवहार की विशेषता के लिए एक अत्यधिक विश्वसनीय, व्यापक प्रणाली स्थापित करना महत्वपूर्ण है। ऐसी प्रणाली कैंसर मेटास्तासिस के आणविक नियमन और स्तरीकृत, सटीक चिकित्सीय रणनीतियों के सफल विकास के अवसर की स्पष्ट समझ दे सकती है। इसलिए, कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार का सटीक निर्धारण जैसे कि जीन (एस) के लाभ या कार्य की हानि के साथ प्रवास और आक्रमण कैंसर कोशिकाओं की आक्रामक प्रकृति के आकलन की अनुमति देता है। सेल बाधा के आधार पर वास्तविक समय माप प्रणाली शोधकर्ताओं को लगातार एक पूरे प्रयोग के दौरान डेटा प्राप्त करने और तुरंत विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में परिणामों की तुलना और मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाती है। पारंपरिक तरीकों के विपरीत, इस विधि को माइग्रेट या आक्रमण करने वाली कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए निर्धारण, धुंधला और नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता नहीं होती है। यह विधि पत्र प्रवास और ग्लियोब्लास्टोमा कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण के वास्तविक समय निर्धारण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं पर जोर देता है।
Introduction
कैंसर विभिन्न अंगों को मेटास्टेसाइज करने की क्षमता के कारण घातक बीमारी है। कैंसर जीनोटाइप और फेनोटाइप का निर्धारण प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों को समझने और डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है। कैंसर अनुसंधान के दशकों के विकास और विभिन्न तरीकों के अनुकूलन के लिए कैंसर जीनोटाइप और फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए नेतृत्व किया है । नवीनतम तकनीकी विकास में से एक सेल बाधा के आधार पर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय माप है। सब्सट्रेट्स और सेल-सेल संपर्कों के लिए सेल आसंजन सेल-टू-सेल संचार और विनियमन, विकास और ऊतकों के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कोशिका आसंजन में असामान्यताएं कोशिका-कोशिका संपर्क, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के क्षरण और कोशिकाओं द्वारा प्रवासी और हमलावर क्षमताओं के लाभ का कारण बनती हैं, जिनमें से सभी विभिन्न अंगों1,,2में कैंसर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस में योगदान देते हैं। सेल माइग्रेशन (घाव भरने और बॉयडन चैंबर परख) और आक्रमण (मैट्रीगेल-बॉयडेन चैंबर परख)3,4,4,5निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीके उपलब्ध हैं। ये पारंपरिक तरीके अर्धमात्रात्मक हैं क्योंकि कोशिकाओं को सेल फेनोटाइप को मापने के लिए प्रयोग से पहले या बाद में फ्लोरोसेंट रंगया अन्य रंगों के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, घाव साइट पर कोशिकाओं के प्रवास को मापने के लिए घाव बनाने के लिए कुछ मामलों में यांत्रिक अवरोधों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ये मौजूदा तरीके समय लेने वाली, श्रम-प्रधान हैं, और परिणामों को केवल एक समय बिंदु पर मापते हैं। इसके अलावा, इन तरीकों को प्रायोगिक प्रक्रिया6के दौरान असंगत हैंडलिंग के कारण गलत माप बनाने के लिए प्रवण हैं ।
पारंपरिक तरीकों के विपरीत, वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली कोशिकाओं के पूर्व या पोस्टस्टेनिंग और यांत्रिक क्षति की आवश्यकता के बिना वास्तविक समय में सेल बाधा को मापता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि किसी प्रयोग की अवधि बढ़ाई जा सकती है ताकि जैविक प्रभावों का निर्धारण समय पर निर्भर तरीके से किया जा सके । प्रयोग को क्रियांवित करना समय कुशल है और श्रम-प्रधान नहीं है। डेटा का विश्लेषण अपेक्षाकृत सरल और सटीक है। अन्य तरीकों की तुलना में, यह विधि सेल माइग्रेशन और आक्रमण6,,7,,8,99को मापने के लिए सबसे अच्छा वास्तविक समय माप में से एक है।
गिएवर और कीज़ सबसे पहले इलेक्ट्रोड10की सतह पर एक सेल आबादी की बाधा आधारित माप का वर्णन करने वाले थे। वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली एक ही सिद्धांत पर काम करती है। प्रत्येक माइक्रोप्लेट का क्षेत्र लगभग 80% है जो सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड की एक सरणी से ढका हुआ है। जब इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र कोशिकाओं के पालन या प्रसार के कारण कोशिकाओं द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, तो विद्युत बाधा बदल जाती है। यह बाधा कोशिका सूचकांक के रूप में प्रदर्शित होती है, जो माइक्रोपोरस झिल्ली में प्रवेश करने के बाद इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र को कवर करने वाली कोशिकाओं के सीधे आनुपातिक होती है (इस झिल्ली का औसत ताकना आकार 8 माइक्रोन है)11।
Crk और CrkL SH2 और SH3 डोमेन युक्त अनुकूलक प्रोटीन हैं और साइटोस्केलेटन विनियमन, सेल परिवर्तन, प्रसार, आसंजन, विशेषण-मेसेन्हीमल संक्रमण, प्रवास, आक्रमण, और मेटास्तासिस जैसे विभिन्न सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, कई सिग्नलिंग रास्तों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में मध्यस्थता करके1,,12,,13,,14,,15,,16,17, 17, 17,, 18. इसलिए, कैंसर कोशिकाओं की सीआरके/सीआरकेएल-निर्भर प्रवासी और आक्रामक क्षमताओं का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है । सीआरसी और सीआरकेएल के जीन नॉकडाउन पर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की प्रवासी और आक्रामक क्षमताओं को निर्धारित करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण किया गया था।
यह विधि पत्र Crk-और CrkL-मध्यस्थता प्रवास और मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के आक्रमण के विस्तृत माप का वर्णन करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय माप एक सरल, त्वरित और निरंतर निगरानी प्रक्रिया है जिसमें पारंपरिक तरीकों पर कई, महत्वपूर्ण लाभ हैं जो एक ही समय ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वास्तविक समय सेल विश्लेषण प्रणाली डेटा के साथ उसकी तकनीकी सहायता के लिए ओलिविया दुर्गंध का शुक्रिया अदा करते हैं । हम इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए बच्चों की दया कंसास सिटी में चिकित्सा लेखन केंद्र का भी शुक्रिया अदा करते हैं। इस काम को टॉम Keaveny बाल चिकित्सा कैंसर अनुसंधान के लिए कोष संपन्न कोष द्वारा समर्थित था (टीपी के लिए) और बच्चों की दया अस्पताल मिडवेस्ट कैंसर एलायंस पार्टनर सलाहकार बोर्ड धन (टीपी के लिए) द्वारा ।
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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