Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas
Summary
O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar a capacidade das células cancerígenas de migrare e invadir diversas condições de tratamento é crucial para avaliar estratégias terapêuticas. Este protocolo apresenta um método para avaliar as habilidades metastáticas em tempo real de uma linha de células cancerígenas do glioblastoma.
Abstract
O câncer surge devido à proliferação descontrolada de células iniciada por instabilidade genética, mutações e fatores ambientais e outros fatores de estresse. Essas anormalidades adquiridas em redes de sinalização molecular complexas e multicamadas induzem a proliferação e sobrevivência de células aberrantes, degradação da matriz extracelular e metástase em órgãos distantes. Estima-se que aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer sejam causadas pelos efeitos diretos ou indiretos da disseminação metastática. Por isso, é importante estabelecer um sistema altamente confiável e abrangente para caracterizar comportamentos de células cancerígenas em manipulações genéticas e ambientais. Tal sistema pode dar uma clara compreensão da regulação molecular da metástase do câncer e da oportunidade para o desenvolvimento bem-sucedido de estratégias terapêuticas estratificadas e precisas. Assim, a determinação precisa de comportamentos de células cancerígenas como migração e invasão com ganho ou perda de função de genes permite avaliar a natureza agressiva das células cancerosas. O sistema de medição em tempo real baseado na impedância celular permite que os pesquisadores adquiram continuamente dados durante todo um experimento e comparem e quantifiquem instantaneamente os resultados em várias condições experimentais. Ao contrário dos métodos convencionais, este método não requer fixação, coloração e processamento de amostras para analisar células que migram ou invadem. Este artigo do método enfatiza procedimentos detalhados para determinação em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas de glioblastoma.
Introduction
O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar genótipos e fenótipos do câncer é fundamental para compreender e projetar estratégias terapêuticas eficazes. Décadas de pesquisa sobre câncer levaram ao desenvolvimento e adaptação de diferentes métodos para determinar genótipos e fenótipos do câncer. Um dos mais recentes desenvolvimentos técnicos é a medição em tempo real da migração celular e invasão baseada na impedância celular. A adesão celular a substratos e contatos celulares desempenham um papel importante na comunicação e regulação celular-célula, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Anormalidades na adesão celular levam à perda do contato celular-celular, degradação da matriz extracelular (ECM) e ganho de capacidades migratórias e invasoras por células, que contribuem para a metástase de células cancerosas para diferentes órgãos1,2. Vários métodos estão disponíveis para determinar a migração celular (cicatrização de feridas e ensaios da câmara de Boyden) e invasão (ensaio de câmara Matrigel-Boyden)3,4,5. Esses métodos convencionais são semiquantitativos porque as células precisam ser rotuladas com um corante fluorescente ou outros corantes antes ou depois do experimento para medir fenótipos celulares. Além disso, são necessárias interrupções mecânicas em alguns casos para a criação de uma ferida para medir a migração das células para o local da ferida. Além disso, esses métodos existentes são demorados, intensivos em mão-de-obra e medem os resultados em apenas um ponto de tempo. Além disso, estes métodos são propensos a fazer medições imprecisas devido ao manuseio inconsistente durante o procedimento experimental6.
Ao contrário dos métodos convencionais, o sistema de análise celular em tempo real mede a impedância celular em tempo real sem exigir danos pré ou pós-coloração e mecânicos das células. Mais importante, a duração de um experimento pode ser estendida para que os efeitos biológicos possam ser determinados de forma dependente do tempo. Executar o experimento é eficiente em tempo e não é trabalhoso. Analisar dados é relativamente simples e preciso. Comparado a outros métodos, este método é uma das melhores medidas em tempo real para medir a migração e invasão celular6,7,8,9.
Giaever e Keese foram os primeiros a descrever a medição baseada em impedância de uma população celular na superfície dos eletrodos10. O sistema de análise celular em tempo real funciona com o mesmo princípio. A área de cada poço de microplacas é aproximadamente 80% coberta com uma matriz de microeletrodos de ouro. Quando a área da superfície do eletrodo é ocupada por células devido à adesão ou disseminação das células, a impedância elétrica muda. Esta impedância é exibida como o índice celular, que é diretamente proporcional às células que cobrem a área da superfície do eletrodo depois de penetrarem na membrana microporosa (o tamanho médio dos poros desta membrana é de 8 μm)11.
Crk e CrkL são proteínas adaptoras que contêm domínios SH2 e SH3 e desempenham papéis importantes em várias funções celulares, como regulação de citoesqueleto, transformação celular, proliferação, adesão, transição epitelial-mesenquimal, migração, invasão e metástase por mediação de interações proteína-proteína em muitas,1,12,13,14,15,16,17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 ,1717 18. Por isso, é importante determinar as capacidades migratórias e invasivas dependentes de Crk/CrkL das células cancerígenas. A análise celular em tempo real foi realizada para determinar as habilidades migratórias e invasivas das células de glioblastoma após a derrubada genética de Crk e CrkL.
Este artigo do método descreve medições detalhadas da migração mediada por Crk e CrkL e invasão de células de glioblastoma humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medição em tempo real da migração e invasão de células usando o sistema de análise celular em tempo real é um processo de monitoramento simples, rápido e contínuo com múltiplas vantagens significativas sobre os métodos tradicionais que fornecem dados em um único ponto de tempo. Assim como os métodos tradicionais, as condições experimentais devem ser otimizadas para cada linha celular para o sistema de análise celular em tempo real, pois cada linha celular pode ser diferente em termos de sua adesão ao …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos olivia funk por sua assistência técnica com os dados do sistema de análise celular em tempo real. Também agradecemos ao Centro de Escrita Médica do Children’s Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e pelo Children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (para TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
