Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.
Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) n’imitent pas la croissance in vivo de tumeur de manière satisfaisante. Par conséquent, des modèles sphéroïdes de culture tridimensionnels (3D) ont été développés. Ces modèles peuvent être particulièrement importants dans le domaine de la neuro-oncologie. En effet, les tumeurs cérébrales ont tendance à envahir l’environnement sain du cerveau. Nous décrivons ici dans un essai idéal de glioblastoma spheroid-basé que nous avons développé pour étudier l’invasion de tumeur. Nous fournissons tous les détails techniques et les outils analytiques pour effectuer avec succès cet essai.
Dans la plupart des études utilisant des lignées cellulaires primaires ou disponibles dans le commerce, des essais sont effectués sur des cellules cultivées sur des surfaces en plastique comme cultures monocouches. La gestion de la culture cellulaire en 2D représente des inconvénients, car elle n’imite pas un environnement cellulaire in vivo 3D. Dans les cultures 2D, toute la surface cellulaire est directement en contact avec le milieu, modifiant la croissance cellulaire et modifiant la disponibilité des médicaments. En outre, la surface plastique non physiologique déclenche la différenciation cellulaire1. Des modèles de culture tridimensionnels ont été développés pour surmonter ces difficultés. Ils ont l’avantage d’imiter l’architecture multicellulaire et l’hétérogénéité des tumeurs2, et pourrait donc être considéré comme un modèle plus pertinent pour les tumeurs solides3. La morphologie complexe des sphéroïdes contribue à mieux évaluer la pénérance et la résistance des médicaments4. L’hétérogénéité tumorale dans le sphéroïde a un impact sur la diffusion de l’oxygène et des nutriments, et la réponse aux agents pharmacologiques (figure 1A). La diffusion de l’oxygène est modifiée lorsque la taille du sphéroïde atteint 300 m, induisant un environnement hypoxique au centre du sphéroïde(figure 1A,C). Les métabolites sont également moins pénétrants à travers les couches cellulaires et les réactions métaboliques compensatoires ont lieu5. Lorsque le diamètre du sphéroïde augmente, des noyaux nécrotiques peuvent être observés, imitant davantage les caractéristiques trouvées dans de nombreux cancers solides, y compris le glioblastome agressif de cancer du cerveau (GBM)6.
Plusieurs essais d’invasion 2D ou 3D pour le glioblastome ont été rapportés dans la littérature7,8. Les essais bidimensionnels sont principalement pour étudier l’invasion dans un plan horizontal sur une fine couche de matrice ou dans un essai de chambre Boyden9. Des essais tridimensionnels ont été décrits avec des cultures sphéroïdes 3D utilisant des lignées cellulaires classiques de glioblastome10. Des variantes plus complexes sont représentées par l’invasion des organoïdes cérébraux par des sphéroïdes tumoraux dans les cultures de confrontation11. Cependant, il est toujours important de développer un essai facile à utiliser et reproductible à la disposition de n’importe quel laboratoire. Nous avons mis au point un protocole pour générer des cellules souches de glioblastome à partir d’échantillons de patients. La quantification de ces essais est facilement gérable et ne nécessite qu’un logiciel en ligne en libre accès. En bref, les morceaux de tumeur sont coupés en petits morceaux et enzymatiquement digérés. Les cellules simples dérivées de la digestion sont cultivées dans le milieu neurobasal. Après 4-7 jours, les structures sphéroïdes se forment spontanément. Sur l’implantation intracrânienne dans les modèles de souris, ils forment des tumeurs présentant un noyau nécrotique entouré de cellules pseudo-palisading12. Cela ressemble étroitement aux caractéristiques trouvées dans les patients gbM.
Dans cet article, nous décrivons notre protocole pour produire des sphéroïdes à partir d’un nombre déterminé de cellules pour assurer la reproductibilité. Deux matrices complémentaires peuvent être utilisées à cette fin : le matrigel et le type de collagène I. Matrigel est enrichi en facteurs de croissance et imite la membrane basale mammifère nécessaire à l’attachement et à la migration des cellules. D’autre part, le type de collagène I, un élément structurel du stroma, est la matrice extracellulaire fibrillaire la plus commune et est utilisé dans les essais d’invasion cellulaire. Ici, nous élisons notre modèle de sphéroïde GBM en effectuant des essais de migration et de prolifération. L’analyse a été effectuée non seulement aux points fixes, mais aussi en surveillant l’expansion des sphéroïdes et le mouvement cellulaire par imagerie en direct. En outre, la microscopie électronique a été faite pour visualiser les détails morphologiques.
Les essais sphéroïdes de tumeur sont bien adaptés pour étudier les caractéristiques de tumeur comprenant la prolifération, l’invasion, et la migration, aussi bien que la mort cellulaire et la réponse de drogue. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D formant un microtumor invasif, comme on le voit dans la figure 4B,C. Pendant le processus invasif, les métalloproteinases de matrice (MMP) digèrent les matrices entourant les cellules tumorales<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon est diplômé du CHU de Toulouse.
96 well round-bottom plate | Falcon | 08-772-212 | |
Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme |
B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
Fiji software | ImageJ | Used to analyze pictures | |
Flask 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
Matrigel | Corning | 354230 | Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM |
Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
NBM | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Stored at 4 °C |
Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used to cell counting |
Type I Collagen | Corning | 354236 | Stored at 4 °C |