هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.
وغالبا ما تتعرض الكائنات الحية لبيئات متقلبة والتغيرات في التوازن داخل الخلايا، والتي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على البروتيوم وعلم وظائف الأعضاء. وهكذا، تطورت الكائنات الحية استجابات محددة ومحددة للإجهاد مخصصة لإصلاح الأضرار والحفاظ على التوازن. وتشمل هذه الآليات استجابة البروتين تكشفت من التبائص التليسفي (UPRER),استجابة البروتين تكشفت من الميتوكوندريا (الاستعراض الدوري الشاملMT),استجابة الصدمة الحرارية (HSR), واستجابة الإجهاد التأكسدي (OxSR). البروتوكولات المعروضة هنا تصف طرق الكشف عن وتوصيف تفعيل هذه المسارات وعواقبها الفسيولوجية في النيماتودا، C. elegans. أولاً، يتم وصف استخدام المراسلين الفلورسنتالنسخي ينفين على المسارات الخاصة بتوصيف خلوي سريع، أو فحص المخدرات، أو الفحص الجيني على نطاق واسع (على سبيل المثال، المكتبات RNAi أو المتحولة). بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف المقالات الفسيولوجية التكميلية والقوية ، والتي يمكن استخدامها لتقييم حساسية الحيوانات مباشرة لإجهادات محددة ، وتعمل كتحقق وظيفي من المراسلين النسخة. معا، تسمح هذه الأساليب لتوصيف سريع للآثار الخلوية والفسيولوجية من اضطرابات البروتيوات السمية الداخلية والخارجية.
إن قدرة الكائن الحي على الاستجابة للتغيرات في البيئة داخل الخلايا وداخلها أمر بالغ الأهمية لبقائه والتكيف معه. ويتم ذلك على المستوى الخلوي من خلال العديد من المسارات الوقائية التي تضمن سلامة الخلية. في حين أن العديد من المكونات الخلوية تخضع للضرر المرتبط بالإجهاد ، فإن إحدى المشاركات الرئيسية لاستجابات الإجهاد الخلوي هي إصلاح وحماية التوازن في البروتيوم الخلوي. ومع ذلك ، فإن تقسيم البروتينات إلى هياكل خاصة ، تسمى العضيات ، يشكل تحديًا للخلية ، حيث لا يمكنها الاعتماد على شكل مركزي واحد من مراقبة جودة البروتين لضمان طي جميع البروتينات داخل الخلية بشكل صحيح ووظيفية. لذلك ، للتعامل مع الاضطرابات في بروتيناتها ، طورت العضيات آليات مخصصة لمراقبة الجودة ، والتي يمكن أن تشعر بالبروتينات المطوية وتنشط استجابة الإجهاد في محاولة لتخفيف التوتر داخل تلك المقصورة. على سبيل المثال، يعتمد السيتوسول على استجابة الصدمات الحرارية (HSR)، في حين يعتمد التتشني الإندوسليعلى الإندوبلازمي (ER) والميتوكوندريا على استجابات البروتين المتكشفة الخاصة بالمقصورة (UPR). يعمل OxSR على تخفيف الآثار السامة لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يتم تشغيل كل استجابة الإجهاد في وجود تحديات الخلوية والشتائم البيئية ويحفز استجابة النسخ مصممة خصيصا. وتشمل السمات المميزة لهذه الاستجابات توليف الجزيئات التي تعيد طي البروتينات المطوية (مثل المرافقين) التي تستهدف العضية المناسبة، أو بدلا ً من ذلك، إزالة البروتينات التالفة بسبب تدهور البروتين. الفشل في تنشيط هذه الاستجابات الإجهاد يؤدي إلى تراكم البروتينات التالفة، والخلل الخلوي نشرها إلى فشل الجهازية من الأنسجة، والموت في نهاية المطاف من الكائن الحي. يتم مراجعة وظيفة وتنظيم استجابات الإجهاد المختلفة في مكان آخر1.
وقد نسبت العديد من الأفكار المتعلقة بتنظيم ونشاط استجابات الإجهاد الخلوي إلى النيماتودا، Caenorhabditis elegans،وهو كائن حي نموذج متعدد الخلايا في البحوث الوراثية. الديدان الخيطية لا تسمح فقط دراسة تفعيل استجابات الإجهاد على المستوى الخلوي، ولكن أيضا على مستوى الكائن الحي. وقد استخدمت الديدان الخيطية لدراسة آثار الاضطرابات الوراثية أو التعرض للأدوية والملوثات على نموها وبقائها. فوقت الجيل السريع، والايزوجيني، والشفافية، وقابلية القابلية للاستبصاء الوراثي، وسهولة الاستخدام أثناء التجريب تجعلها مثالية لمثل هذه الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستجابة الفسيولوجية السريعة نسبيًا للإجهاد (بين ساعات وبضعة أيام) والحفاظ التطوري على المسارات الخلوية تجعل الديدان الخيطية أداة بارزة في دراسة مقاومة الإجهاد.
هناك نوعان من سلالات القولونية شائعة الاستخدام المستخدمة كمصدر غذائي لزراعة C. elegans: OP50 القياسية ، وهي سلالة B التي تم تنفيذ معظم التجارب تاريخيا2 و HT115 ، سلالة K – 12 التي تستخدم تقريبا لجميع تجارب RNAI3،4. من المهم أن نلاحظ أن هناك اختلافات كبيرة بين OP50 وHT115 الوجبات الغذائية البكتيرية. وقد ثبت أن النمو على هذه المصادر البكتيرية المختلفة يسبب اختلافات كبيرة في التشكيل الجانبي الأيضي ، وعدد نسخة الحمض النووي الميتوكوندريا ، والعديد من الأنماط الظاهرية الرئيسية ، بما في ذلك عمر5. وتعزى بعض هذه الاختلافات إلى نقص فيتامين B12 المرتبطة بالنمو على بكتيريا OP50, التي يمكن أن تؤدي إلى عيوب في التوازن الميتوكوندريا وزيادة الحساسية لمسببات الأمراض والضغوط. وقد ثبت أن جميع هذه الأنماط الظاهرية خففت من النمو على البكتيريا HT115, التي لديها مستويات أعلى من فيتامين B126. لذلك ، يوصى بإجراء جميع التجارب على استجابات الإجهاد الفسيولوجي على بكتيريا HT115 ، بغض النظر عن ضرورة ظروف RNAi. ومع ذلك ، نظرا لسهولة الحفاظ على الحيوانات على OP50 ، يمكن إجراء جميع النمو القياسي (أي صيانة وتضخيم الحيوانات) على OP50 ، حيث لم يتم اكتشاف اختلافات كبيرة في النماذج التجريبية الموصوفة هنا في الديدان التي يتم الحفاظ عليها على OP50 طالما تم نقلها إلى مزامنة HT115 بعد (أي من فتحة ما بعد التبييض مع أو بدون L1 الاعتقال) حتى التجريب.
هنا ، وصف توصيف نشاط استجابات الإجهاد الخلوي باستخدام طريقتين وظيفيتين. تجدر الإشارة إلى أن البروتوكولات المعروضة تركز في المقام الأول على استجابات الإجهاد الخلوي وتأثيرها على التوازن البروتيني. أولاً، يتم استخدام المراسلين الفلوريين النسخي، والتي يتم تنظيمها من قبل مروجي الجينات الذاتية التي يتم تنشيطها على وجه التحديد استجابة لضغوط خلوية مختلفة. ويستند هؤلاء المراسلين النسخ الفلوري ة على الحث النسخي لجينات محددة التي هي في الأصل جزء من استجابة الإجهاد. على سبيل المثال، يتم تنشيط HSP-4، وهو بروتين صدمة حرارية تقويم العظام إلى hSPA5/BiP المرافق البشري، على ER-stress وlocalizes إلى ER لتخفيف التوتر. في ظروف الإجهاد ER (على سبيل المثال، التعرض لتونيمايسين)، يتم تصنيع بروتين فلورسنت أخضر (GFP)، وضعت تحت تنظيم المروج hsp-4، في مستويات عالية كما يمكن تقييمها عن طريق المجهر الفلورسنت أو قياسها كميا باستخدام قياس خلايا تدفق الجسيمات الكبيرة من النيماتودا7. وبالمثل، يستخدم المروج للمرافق الميتوكوندريا، hsp-6 (orthologous لالثدييات HSPA9)، لرصد تفعيلMT8الاستعراض الدوري الشامل ، ويستخدم المروج للsperone ssp-16.2 (orthologous لجينات ألفا البلورية البشرية) لتقييم نشاط HSR9. ويسمح هؤلاء المراسلون بتوصيف سريع للمسارات التي يتم تفعيلها استجابة لمختلف الاضطرابات.
في كثير من الأحيان ، يتم تصوير المراسلين المعروضين هنا باستخدام المجهر ، والذي يوفر إخراجًا نوعيًا لتفعيل استجابات الإجهاد. ومع ذلك، في حين توفر تقنيات التصوير معلومات عن كثافة المراسلين المذكورين أعلاه وموقع نسيجهم، فإن قياسها الكمي ليس دائماً دقيقاً أو قوياً. في حين أنه من الممكن قياس تنشيط الفلورسنت باستخدام أدوات تحليل التصوير ، فإن هذه الطرق منخفضة الإنتاجية نسبيًا وحجم العينة صغير ، نظرًا للعدد المنخفض نسبيًا من الحيوانات المصوّرة. سهولة والقدرة على الحصول على كميات كبيرة من الحيوانات بسرعة جعل C. elegans نظام نموذج مثالي لقياس تفعيل المراسلين الإجهاد الفلورسنت من خلال استخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة. مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة قادر على التسجيل والتحليل والفرز استنادًا إلى الحجم والفلورسال من العديد من الحيوانات الحية. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن الحصول على كثافة الفلورسنت ، وحجمها ، وكذلك المعلومات المكانية (2D) لآلاف الديدان. يتم التحكم في النظام باستخدام FlowPilot ، والذي يسمح بالحصول على البيانات في الوقت الحقيقي وتحليل المعلمات المقاسة. هنا ، يتم تقديم طرق لكل من التصوير المجهري والتحليل الكمي باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة كطرق لقياس تنشيط استجابات الإجهاد.
أبعد من تحليل المراسل ، يمكن قياس حساسية أو مقاومة الحيوانات للإجهاد باستخدام مقيس الإجهاد الفسيولوجي. ويتحقق ذلك من خلال تعريض الحيوانات لبيئات مجهدة تنشط مسارات إجهاد خلوي محددة. هنا ، يتم توفير العديد من الطرق لقياس حساسية الحيوانات بأكملها لأنواع محددة من الضغوطات.
يتم تطبيق الإجهاد ER إلى C. elegans باستخدام العامل الكيميائي, tunicamycin, الذي يمنع N المرتبطة glycosylation, مما تسبب في تراكم البروتينات أضعاف في ER10. في C. elegans, النمو عند التعرض لتونيماشين النتائج في اضطرابات كبيرة في وظيفة الطوارئ, وانخفاض كبير في عمر11. من خلال قياس بقاء الحيوانات على لوحات تحتوي على تونياميسين ، يمكن قياس حساسية الإجهاد ER للحيوانات. على سبيل المثال، الحيوانات مع الحث UPRER خارج الرحم، وبالتالي زيادة المقاومة للبروتين الإجهاد misfolding في ER لديها زيادة البقاء على قيد الحياة على التعرض تونيماشين مقارنة مع الحيوانات البرية من النوع12.
يتم تطبيق الإجهاد التأكسدي والميتوكوندريا على C. elegans عن طريق تعريض الحيوانات للعامل الكيميائي، الباراكوات. الباراكوات هو مبيد أعشاب شائع الاستخدام ، والذي يسبب تكوين أكسيد فائق على وجه التحديد في الميتوكوندريا13. نظرًا للتوطين المحدد لأنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الميتوكوندريا (ROS) ، غالبًا ما تستخدم المقالات الباراكوات كقياس الإجهاد “الميتوكوندريا”. ومع ذلك، يتم تحويل أكسيد فائق بسرعة إلى بيروكسيد الهيدروجين بواسطة ديزموتاس سوبر أكسيد الميتوكوندريا (SODs)14. يمكن أن ينتشر بيروكسيد الهيدروجين لاحقًا من الميتوكوندريا ويسبب الإجهاد التأكسدي في مقصورات أخرى من الخلية. لذلك ، فإننا نصف المقالات البقاء على قيد الحياة الباراكوات وقياس الحساسية لكل من الميتوكوندريا والأكسدة (يمكن العثور على غيرها من المؤكسدات المؤكسدة الكم15).
يتم تنفيذ المقالات الحرارية في C. elegans عن طريق وضع الحيوانات في درجات حرارة مرتفعة. درجات الحرارة المحيطة للنيماتودا ~ 15-20 درجة مئوية ويتم حث الإجهاد الحراري في درجات حرارة أعلى من 25 درجة مئوية16،17. يتم تنفيذ المقالات الحرارية عموما في درجات حرارة تتراوح بين 30-37 درجة مئوية، كما تظهر الحيوانات العيوب الخلوية الرئيسية في هذه الحرارة، ويتم الانتهاء من المقالات البقاء على قيد الحياة في غضون 24 ساعة16،,18. هنا، يتم توفير طريقتين بديلتين لأداء المقالات الحرارية: النمو عند 34 درجة مئوية والنمو عند 37 درجة مئوية. معا، يمكن استخدام البروتوكولات المعروضة هنا لأداء شاشات واسعة النطاق عند دمجها مع الجينات القياسية بالضربة القاضية باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو مكتبات الأدوية الكيميائية.
ويمكن تقسيم البروتوكول إلى 4 إجراءات واسعة – نمو C. elegans والتحضير للتصوير (القسمين 1 و 2)، وتصوير المراسلين النسخباستخدام المجهر الفلوري (الأقسام 3-5)، والقياسات الكمية للمراسلين الذين يستخدمون مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة (القسم 6)، والمقاييس الفسيولوجية لقياس حساسية الإجهاد في C. elegans (القسم 7).
هنا ، يتم وصف طرق استجواب استجابات الإجهاد الخلوي في C. elegans، وذلك باستخدام المراسلين النسخ الفلوري ومقالات البقاء على قيد الحياة الإجهاد الفسيولوجي. يستخدم جميع المراسلين تعبير GFP مدفوعًا تحت مروج هدف النسخ التنازلي لعوامل النسخ المشاركة في استجابات الإجهاد الخلوي المتصاعدة. استخدا…
The authors have nothing to disclose.
R.BZ، R.BZ، مدعومة من قبل زمالة EMBO على المدى الطويل ومؤسسة لاري إل هيلبلوم. يتم دعم R.H.S من خلال منحة 5F32AG032023-02 من خلال المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ومؤسسة جلين للبحوث الطبية زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم A.F. من قبل منحة F32AG051355 من خلال NIA. يتم دعم H.K.G. من خلال منحة DGE1752814 من خلال برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم. يتم دعم M.G.M. من قبل 1F31AG060660-01 من خلال NIA. يتم دعم A.D. من قبل مؤسسة توماس وستايسي سيبل، ومعهد هوارد هيوز الطبي، و4R01AG042679-04 و 5R01AG055891-02 من NIA، و 5R01ES021667-09 من NIEHS. نشكر لاري جو، ميليسا سانشيز، نامكيت، وأنيل إسكيفل على المساعدة التقنية الكبيرة. نشكر مختبر موريموتو وCGC (بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرنامج البنية التحتية للبحوث P40 OD010440) على السلالات.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | for mitochondrial stress |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | for NGM plates |
BD Difco granulated agar | VWR | 90000-782 | for NGM plates |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 97061-904 | for NGM plates |
Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | for RNAi |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | for NGM plates |
COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | equipped with a 488 nm light source. |
COPAS Cleaning Solution | Union Biometrica | 300-5072-000 | to use with COPAS |
COPAS Sheath Solution | Union Biometrica | 300-5070-100 | to use with COPAS |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | solvent for drugs |
IPTG dioxane free | Denville Scientific | CI8280-4 | for RNAi |
LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | for LB |
M205FA stereoscope | Leica | 10450040 | equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | for NGM plates, M9 |
Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | for oxidative/mitochondrial stress |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | for bleach soluton |
Potassium phosphate dibasic | VWR | EM-PX1570-2 | for NGM plates |
Potassium phosphate monobasic | VWR | EM-PX1565-5 | for M9 |
Revolve | ECHO | 75990-514 | equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | for imaging |
Sodium Chloride | EMD Millipore | SX0420-5 | for NGM plates, M9 |
Sodium phosphate dibasic | VWR | 71003-472 | for M9 |
Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | for oxidative stress |
Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | for RNAi |
Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | for ER stress |