JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Målinger af fysiologiske stressreaktioner i C. Elegans

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

Her karakteriserer vi cellulære proteotoksiske stressreaktioner i nematoden C. elegans ved at måle aktiveringen af fluorescerende transskriptionelle journalister og assaying følsomhed over for fysiologisk stress.

Abstract

Organismer er ofte udsat for svingende miljøer og ændringer i intracellulær homøostase, som kan have skadelige virkninger på deres proteom og fysiologi. Således har organismer udviklet målrettede og specifikke stress reaktioner dedikeret til at reparere skader og vedligeholde homøostase. Disse mekanismer omfatter udfoldet protein respons af endoplasmic reticulum (UPRER),udfoldet protein respons af mitokondrier (UPRMT),varmechok respons (HSR), og oxidative stress respons (OxSR). De protokoller, der præsenteres her beskrive metoder til at opdage og karakterisere aktivering af disse veje og deres fysiologiske konsekvenser i nematode, C. elegans. For det første er brugen af pathway-specifikke fluorescerende transskriptionelle journalister beskrevet for hurtig cellulær karakterisering, narkotika screening, eller storstilet genetisk screening (f.eks RNAi eller mutant biblioteker). Desuden beskrives komplementære, robuste fysiologiske analyser, som kan bruges til direkte at vurdere dyrenes følsomhed over for specifikke stressfaktorer, der tjener som funktionel validering af de transskriptionelle reportere. Sammen, disse metoder giver mulighed for hurtig karakterisering af de cellulære og fysiologiske virkninger af interne og eksterne proteotoksiske forstyrrelser.

Introduction

En organismes evne til at reagere på ændringer i det intra- og ekstracellulære miljø er afgørende for dens overlevelse og tilpasning. Dette opnås på et cellulært niveau gennem mange beskyttende veje, der sikrer integriteten af cellen. Mens mange cellulære komponenter er genstand for stress-associerede skader, en større inddragelse af cellulære stress reaktioner er at reparere og beskytte homøostase af cellulære proteom. Men opdelingen af proteiner i særlige strukturer, kaldet organeller, udgør en udfordring for cellen, da den ikke kan stole på en centraliseret form for proteinkvalitetskontrol for at sikre, at alle proteiner i cellen er korrekt foldet og funktionelt. Derfor, at beskæftige sig med forstyrrelser til deres proteiner, organeller har udviklet dedikerede kvalitetskontrol mekanismer, som kan fornemme fejlfoldede proteiner og aktivere en stress respons i et forsøg på at lindre stress i dette rum. For eksempel er cytosolen afhængig af varmechokresponsen (HSR), mens det endoplasmatiske reticulum (ER) og mitokondrier er afhængige af deres rumspecifikke udfoldede proteinrespons (UPR). OxSR tjener til at lindre de toksiske virkninger af reaktive iltarter (ROS). Hver stress respons udløses i overværelse af cellulære udfordringer og miljømæssige fornærmelser og inducerer en skræddersyet transskriptionel reaktion. Kendetegnende for disse reaktioner omfatter syntese molekyler, der re-fold fejlfoldede proteiner (såsom chaperoner) målrettet til den rette organelle, eller alternativt fjerne beskadigede proteiner ved protein nedbrydning. Undladelse af at aktivere disse stress reaktioner resulterer i ophobning af beskadigede proteiner, cellulære dysfunktion formeret til systemisk svigt af væv, og i sidste ende død af organismen. Funktionen og reguleringen af de forskellige stressreaktioner gennemgås andetsteds1.

Mange indsigter om regulering og aktivitet af cellulære stress reaktioner er blevet tilskrevet nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellet model organisme i genetisk forskning. Nematoder ikke kun tillade at studere aktivering af stress reaktioner på celleniveau, men også på organismeniveau; nematoder er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af genetiske forstyrrelser eller eksponering for narkotika og forurenende stoffer på deres vækst og overlevelse. Deres hurtig generation tid, isogeni, gennemsigtighed, genetiske tractability, og brugervenlighed under eksperimenter gør dem ideelle til sådanne undersøgelser. Derudover gør den relativt hurtige fysiologiske reaktion på stress (mellem timer og et par dage) og den evolutionære bevarelse af cellulære veje nematoder til et fremtrædende redskab til at studere stressresistens.

Der er to almindeligt anvendte E. coli stammer, der anvendes som en fødekilde til at vokse C. elegans: standard OP50, en B-stamme, hvor de fleste eksperimenter er blevet historisk udført2 og HT115, en K-12 stamme, der bruges til næsten alle RNAi eksperimenter3,4. Det er vigtigt at bemærke, at der er betydelige forskelle mellem OP50 og HT115 bakteriel kost. Vækst på disse forskellige bakterielle kilder har vist sig at forårsage store forskelle i metabolisk profil, mitokondriel DNA kopi nummer, og flere store fænotyper, herunder levetid5. Nogle af disse forskelle tilskrives Vitamin B12-mangel forbundet med vækst på OP50 bakterier, hvilket kan resultere i defekter i mitokondrier homøostase og øget følsomhed over for patogener og belastninger. Alle disse fænotyper har vist sig at være lettet ved vækst på HT115 bakterier, som har højere niveauer af Vitamin B126. Det anbefales derfor, at alle forsøg med fysiologiske stressreaktioner udføres på HT115-bakterier, uanset nødvendigheden af RNAi-tilstande. Men på grund af den lethed at opretholde dyr på OP50, alle standard vækst (dvs. vedligeholdelse og forstærkning af dyr) kan udføres på OP50, som betydelige forskelle i de eksperimentelle paradigmer beskrevet her ikke blev påvist i orme opretholdes på OP50, så længe de blev flyttet til HT115 efter synkronisering (dvs. fra luge post-blegning med eller uden L1 arrestation) indtil eksperimentering.

Her er karakteriseringen af aktiviteten af cellulære stressreaktioner ved hjælp af to funktionelle metoder beskrevet. Det skal bemærkes, at de præsenterede protokoller primært er fokuseret på cellulære stress reaktioner og deres indvirkning på protein homøostase. For det første er fluorescerende transskriptionelle journalister udnyttes, som er reguleret af endogene gen initiativtagere, der er specielt aktiveret som reaktion på forskellige cellulære belastninger. Disse fluorescerende transskriptionelle journalister er baseret på transskription af specifikke gener, der er indbygget en del af stress respons. For eksempel aktiveres HSP-4, et varmechokprotein orthologtil den menneskelige chaperone HSPA5/BiP, ved ER-stress og lokaliserer til erefor at afhjælpe belastningen. Under forhold med ER-stress (f.eks. eksponering for tunicamycin) syntetiseres et grønt fluorescerende protein (GFP), der er placeret under regulering af hsp-4-promotor, i høje niveauer, som kan vurderes ved fluorescerende mikroskopi eller kvantitativt målt ved hjælp af large-partikel flow cytometri af nematoder7. Tilsvarende er initiativtageren til en mitokondrielle chaperone, hsp-6 (orthologous til pattedyr HSPA9), anvendes til at overvåge aktiveringen af UPRMT8, og initiativtageren til cytosolic chaperone hsp-16.2 (orthologous til humankrystallin alpha gener) anvendes til at vurdere aktiviteten af HSR9. Disse journalister tillader en hurtig karakterisering af de veje, der aktiveres som reaktion på forskellige forstyrrelser.

Ofte er de journalister, der præsenteres her, afbildet ved hjælp af mikroskopi, som giver et kvalitativt output af aktiveringen af stressreaktioner. Men mens billeddannelsesteknikker giver både oplysninger om intensiteten og vævsplaceringen af de ovennævnte journalister, er kvantificeringen ikke altid nøjagtig eller robust. Selv om det er muligt at kvantificere fluorescerende aktivering ved hjælp af billedbehandlingsanalyseværktøjer, er disse metoder relativt lave gennemløbsgrad, og stikprøvestørrelsen er lille på grund af det relativt lave antal afbildede dyr. Den lethed og evne til at opnå store mængder af dyr hurtigt gøre C. elegans en ideel model system til at assay aktivering af fluorescerende stress reportere ved hjælp af en stor partikelflow cytometer. En stor partikel flow cytometer er i stand til at registrere, analysere og sortering baseret på størrelse og fluorescens fra mange levende dyr. Ved hjælp af denne metode er det muligt at få fluorescerende intensitet, størrelse og også rumlige (2D) oplysninger for tusindvis af orme. Systemet styres ved hjælp af FlowPilot, som giver mulighed for dataindsamling i realtid og analyse af de målte parametre. Her tilbydes metoder til både mikroskopisk billeddannelse og kvantitativ analyse ved hjælp af et cytometer med stort partikelflow som metoder til at måle aktiveringen af stressrespons.

Ud over reporteranalyse kan dyrenes følsomhed eller modstandsdygtighed over for stress måles ved hjælp af fysiologiske stressanalyser. Dette opnås ved at udsætte dyr for stressende miljøer, der aktiverer specifikke cellulære stressveje. Her findes der flere metoder til at måle hele dyrs følsomhed over for bestemte typer stressfaktorer.

ER-stress påføres C. elegans ved hjælp af den kemiske agens tunicamycin, som blokerer N-forbundet glycosylation, hvilket forårsager akkumulering af misfoldede proteiner i ER10. I C. elegans resulterervæksten ved eksponering for tunicamycin i større forstyrrelser i ER-funktionen og en signifikant nedsat levetid11. Ved at måle dyrenes overlevelse på tunicamycinholdige plader kan er-stressfølsomheden hos dyrene kvantificeres. For eksempel, dyr med ektopisk UPRER induktion og dermed øget resistens over for protein misfolding stress i ER har en øget overlevelse ved tunicamycin eksponering i forhold til vilde dyr12.

Oxidativ og mitokondriel stress påføres C. elegans ved at udsætte dyrene for den kemiske agens, paraquat. Paraquat er et almindeligt anvendt herbicid, som forårsager superoxid dannelse specifikt i mitokondrier13. På grund af den specifikke lokalisering af mitokondrier-afledte reaktive ilt arter (ROS), paraquat assays bruges ofte som en “mitokondriel” stress assay. Superoxid omdannes imidlertid hurtigt til hydrogenperoxid ved mitokondrielt superoxiddismutaser (SODs)14. Hydrogenperoxid kan efterfølgende spredes ud af mitokondrier og forårsage oxidativstress i andre rum i cellen. Derfor beskriver vi paraquat overlevelsesanalyser som måling af følsomhed over for både mitokondriært og oxidativt stress (andre oxidative stressanalyser kan findes15).

Termotoleranceanalyser udføres i C. elegans ved at placere dyr i forhøjede temperaturer. Omgivelsestemperaturerfor nematoder er ~15-20 °C , og der fremkaldes termisk belastning ved temperaturer over 25 °C16,17. Termotoleranceanalyser udføres normalt ved temperaturer fra 30-37 °C, da dyrene udviser store cellulære defekter ved denne temperatur, og overlevelsesanalyser færdiggøres inden for 24 timer16,18. Her findes der to alternative metoder til udførelse af termotoleranceanalyser: vækst ved 34 °C og vækst ved 37 °C. Sammen kan de protokoller, der præsenteres her, udnyttes til at udføre store skærme, når de kombineres med standard genknock-down ved hjælp af RNA-interferens eller kemiske lægemiddelbiblioteker.

Protokollen kan opdeles i 4 brede procedurer- vækst af C. elegans og forberedelse til billeddannelse (afsnit 1 og 2), billeddannelse af transskriptionelle reportere ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (afsnit 3-5), kvantitative målinger af journalister ved hjælp af en stor partikelflowcytometer (afsnit 6) og fysiologiske analyser til måling af stressfølsomhed i C. elegans (afsnit 7).

Protocol

1. Standard vækstbetingelser for temperaturer og OP50 vs HT115 Standardvækst og -ekspansion Der dyrkes en op50-kultur i LB (tabel 1)eller tilsvarende foretrukne medier for 24-48 timer ved omgivelsestemperatur (~22-25 °C). Vokse bakterier ved stuetemperatur som OP50 er en uracil auxotroph og der er en højere forekomst af revertants (f.eks suppressor mutanter), når de dyrkes ved 37 °C. Langtidsopbevaring af OP50-kulturer anbefales ikke (maks. 1 uge ved 4 °C). Der frøs e…

Representative Results

Brug af transskriptionelle journalister til at måle aktivering af stressreaktionerHer er fluorescerende transskriptionelle journalister, der tjener som robuste værktøjer til at måle aktivering af de fleste stress reaktioner i C. elegans. GFP udtryk er drevet under initiativtager til kanoniske mål master transskriptionelle lovgivere involveret i at reagere på rum-specifikke belastninger. Tabel 3indeholder en omfattende liste over alminde…

Discussion

Her beskrives metoder til afhøring af cellulære stressreaktioner i C. elegans– ved hjælp af fluorescerende transskriptionelle journalister og fysiologiske stressoverlevelsesanalyser. Journalisterne alle udnytteR GFP udtryk drevet under initiativtager til en downstream transskriptionelle mål for transskription faktorer, der er involveret i montering cellulære stress reaktioner. Anvendelse af hsp-4p::GFP moduleret af XBP-1s-medieret UPRER, hsp-6p::GFP kontrolleret af ATFS-1-medier…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. støttes af EMBO’s langsigtede stipendium og Larry L. Hillblom Foundation. R.H.S er støttet af tilskud 5F32AG032023-02 gennem National Institute of Aging (NIA) og Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship. A.F. understøttes af tilskud F32AG051355 gennem NIA. H.K.G. er støttet af tilskud DGE1752814 gennem National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. M.G.M. understøttes af 1F31AG060660-01 gennem NIA. AD er støttet af Thomas og Stacey Siebel Foundation, Howard Hughes Medical Institute, og 4R01AG042679-04 og 5R01AG055891-02 fra NIA, og 5R01ES021667-09 fra NIEHS. Vi takker Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet og Anel Esquivel for betydelig teknisk bistand. Vi takker Morimoto lab og CGC (finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for stammer.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011 (2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. 생화학. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. 암 연구학. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. 유전학. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37 (2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792 (2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762 (2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466 (2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701 (2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177 (2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Tags

C. ElegansPhysiological Stress ResponsesStress Response AssayHeat Shock ProteinEndoplasmic Reticulum Unfolded Protein ResponseGFP ReporterSodium AzideMicromanipulationHigh-throughputGenetic PerturbationsPharmacological PerturbationsMolecular And Physiological AnalysisSynchronizationImagingMicroscopy
check_url/kr/61001?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image