מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Summary

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

Abstract

אורגניזמים נחשפים לעתים קרובות לסביבות תנודות ושינויים בהומאוסטזיס תאיים, אשר יכול להיות השפעות מזיקות על פרוטדום ופיזיולוגיה שלהם. כך, האורגניזמים התפתחו ממוקד התגובות לחץ ספציפי מוקדש לתיקון נזק ושמירה על הומאוסטזיס. מנגנונים אלה כוללים את תגובת החלבון המופרש של הרשתית האנדופלזמית (UPR^ER), תגובת החלבון המופרש של המיטותרפיה (Upr^MT), תגובת הלם חום (hsr), ואת תגובת הלחץ חמצוני (oxsr). הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים שיטות לגילוי ולאפיון הפעלת מסלולים אלה ואת ההשלכות הפיזיולוגיות שלהם ב nematode, ג. אלגיה. ראשית, השימוש של כתבים מסוימים פלורסנט ההמרה מוגדר לאפיון סלולרי מהיר, הקרנת סמים, או הקרנה גנטית בקנה מידה גדול (למשל, RNAi או ספריות מוטציה). בנוסף, מתוארים הפיזיולוגיה המשלימה והאיתנה, שניתן להשתמש בה ישירות להערכת רגישות של בעלי חיים לגורמי משתמש ספציפיים, המשמשים כאימות פונקציונלי של הכתבים הטרנסקריפטלים. ביחד, שיטות אלה מאפשרות אפיון מהיר של ההשפעות הסלולר והפיסיולוגיים של רטבאליות רעילים פנימיים וחיצוניים.

Introduction

היכולת של אורגניזם להגיב לשינויים בסביבה הפנים והחילוץ היא חיונית להישרדותה וההסתגלות שלה. זה מושגת על רמה תאית דרך מסלולים הגנה רבים המבטיחים את שלמות התא. בעוד רכיבים סלולריים רבים כפופים נזק הקשורים למתח, מעורבות גדולה של תגובות הלחץ הסלולר היא לתקן ולהגן על הומאוסטזיס של פרוטדום הסלולר. עם זאת, ממדר של חלבונים לתוך מבנים מיוחדים, הנקראים אורגלים, מציב אתגר עבור התא, כפי שהוא לא יכול להסתמך על צורה מרכזית אחת של בקרת איכות חלבון כדי להבטיח כי כל החלבונים בתוך התא הם מקופלים ופונקציונלי כראוי. לכן, כדי להתמודד עם רטבאליות החלבונים שלהם, אורגלים התפתחו מנגנוני בקרת איכות ייעודי, אשר יכול לחוש חלבונים מקופלים ולהפעיל תגובת לחץ בניסיון להקל על הלחץ בתוך התא. לדוגמה, הציטוזול מסתמך על תגובת הלם החום (HSR), בעוד הרשתית האנדופלזמית (ER) והמיטותרפיה מסתמכים על התגובות שלהם לתאים החלבון המופרש (UPR). OxSR משמש כדי להקל על ההשפעות הרעילות של מינים חמצן תגובתי (ROS). כל תגובת מתח מופעלת בנוכחות אתגרים סלולריים ועלבונות סביבתיים ומשרה תגובה מותאמת המותאמת. הסימנים של תגובות אלה כוללים סינתזה מולקולות כי לקפל מחדש חלבונים שאינם מקופלים (כגון מלווים) מיועדים ארגונית נכונה, או לחילופין, להסיר חלבונים פגומים על ידי השפלה חלבון. אי הפעלת תגובות אלה לחץ תוצאות הצטברות של חלבונים פגומים, תפקוד הסלולר הופץ כישלון מערכתי של רקמות, ובסופו של דבר מותו של האורגניזם. הפונקציה והרגולציה של תגובות הלחץ השונות נבדקות במקומות אחרים¹.

תובנות רבות לגבי הרגולציה והפעילות של התגובות לחץ הסלולר יוחסו nematode, האלגיה של Caenorditis, האורגניזם המודל הרב-תאי במחקר גנטי. מתכונדס לא רק לאפשר ללמוד את הפעלת תגובות הלחץ ברמה התאית, אלא גם ברמה ארגונית; נמטודות שימשו כדי ללמוד את ההשפעות של רטבאליות גנטית או חשיפה סמים ומזהמים על הצמיחה שלהם והישרדות. זמן הדור הזריז שלהם, הקימוט, השקיפות, הדחיפה הגנטית וקלות השימוש במהלך הניסויים, הופכים אותם לאידיאליים למחקרים כאלה. בנוסף, התגובה הפיסיולוגית מהירה יחסית למתח (בין שעות ומספר ימים) והשימור האבולוציוני של מסלולים סלולריים להפוך מכשיר בולט במחקר התנגדות לחץ.

ישנם שני זנים נפוצים E. coli המשמשים כמקור מזון לצמוח C. אלגיה: תקן OP50, מאמץ B שבו רוב הניסויים כבר בוצעה היסטורית² ו HT115, זן K-12 המשמש כמעט כל ניסויים rnai^3,4. חשוב לציין כי ישנם הבדלים משמעותיים בין OP50 ו HT115 בקטריאלי דיאטות. צמיחה על אלה מקורות חיידקיים שונים הוכח לגרום הבדלים עיקריים פרופיל מטבולית, מספר העתק מיטוכונדריאלי עותק DNA, ומספר פנוטיפים עיקריים, כולל תוחלת החיים⁵. חלק מההבדלים הללו מיוחסים למחסור בויטמין B12 הקשור לגידול בחיידקים OP50, אשר יכולים לגרום לפגמים בהומאוסטזיס מיטוכונדריאלי ורגישות מוגברת לפתוגנים וללחצים. כל פנוטיפים אלה הוכחו להקלה על ידי צמיחה על HT115 חיידקים, אשר יש רמות גבוהות יותר של ויטמין B12⁶. לכן, מומלץ כי כל הניסויים על התגובות הפיזיולוגיות הלחץ להתבצע על HT115 בקטריה, ללא קשר לצורך של תנאי RNAi. עם זאת, בשל הקלות של שמירה על בעלי חיים על OP50, כל הצמיחה הסטנדרטית (כלומר, תחזוקה והגברה של בעלי חיים) ניתן לבצע על OP50, כמו הבדלים משמעותיים התפיסות הנסיוני שתוארו כאן לא זוהו תולעים המתוחזקות ב OP50 כל עוד הם הועברו לסנכרון HT115 post (כלומר, מתוך הצוהר לאחר ה

כאן, אפיון הפעילות של התגובה ללחץ הסלולר באמצעות שתי שיטות פונקציונלי מתואר. יצוין כי הפרוטוקולים המוצגים מתמקדים בעיקר בתגובות לחץ הסלולר השפעתם על הומאוסטזיס חלבון. ראשית, כתבים פלורסנט להמרה מנוצלים, אשר מוסדרים על ידי היזמים גנים אנדוגני המופעלות במיוחד בתגובה ללחצים סלולריים שונים. אלה כתבים פלורסנט מבוסס על אינדוקציה הטרנסקריפטוניים של גנים ספציפיים כי הם חלק ביסודו של תגובת הלחץ. לדוגמה, HSP-4, חלבון בהלם חום האורתוולוגי אל המלווה האנושי HSPA5/BiP, מופעל על המתח ER ומדגיש את המיון כדי להקל על הלחץ. בתנאים של מתח ER (למשל, חשיפה tunicamycin), חלבון פלורסנט ירוק (gfp), הממוקם תחת התקנה של המקדם hsp-4 , הוא מסונתז ברמות גבוהות כפי שניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ פלורסנט או כימות באמצעות החלקיקים גדול-חלקיק cy, לנסות של נמטודות⁷. באופן דומה, היזם של מלווה מיטוכונדריאלי, hsp-6 (אורתוולוגי HSPA9), מנוצל כדי לפקח על ההפעלה של Upr^MT8, ואת המקדם של המלווה cytosolic hsp-16.2 (אורתוולוגי לגנים האנושיים crystallin alpha) משמש להערכת הפעילות של hsp⁹. כתבים אלה מאפשרים אפיון מהיר של המסלולים המופעלות בתגובה לרטבאליות שונות.

לעתים קרובות, הכתבים המוצגים כאן הם התמונה באמצעות מיקרוסקופ, אשר מספק פלט איכותי של הפעלת תגובות הלחץ. עם זאת, בעוד טכניקות דימות לספק הן מידע על עוצמת ומיקום הרקמה של הכתבים שתוארו לעיל, הקוונפיקציה שלה לא תמיד מדויק או חזק. אמנם ניתן לכמת הפעלת פלורסנט באמצעות כלי ניתוח הדמיה, שיטות אלה הן תפוקה נמוכה יחסית וגודל המדגם קטן, בשל מספר נמוך יחסית של בעלי חיים הדמיה. הקלות והיכולת להשיג כמויות גדולות של בעלי חיים במהירות לעשות C. אלגיה מערכת המודל האידיאלי כדי לעצב את ההפעלה של כתבים הלחץ פלורסנט דרך השימוש של זרם חלקיקים גדול cytometer. Cytometer זרם גדול חלקיקים מסוגל להקליט, ניתוח, ומיון בהתבסס על גודל וקרינה מחיות חיים רבים. באמצעות שיטה זו, ניתן לקבל את עוצמת הפלורסנט, גודל, וגם מרחבית (2D) מידע עבור אלפי תולעים. המערכת נשלטת באמצעות FlowPilot, אשר מאפשר רכישת נתונים בזמן אמת וניתוח של פרמטרים נמדד. כאן, שיטות עבור הדמיה הן מיקרוסקופיים וניתוח כמותי באמצעות cytometer החלקיקים הגדולים זרימה מוצעים כשיטות למדוד את הפעלת תגובות הלחץ.

מעבר לניתוח העיתונאי, הרגישות או ההתנגדות של בעלי חיים ללחץ ניתן למדוד באמצעות הלחץ הפיזיולוגי שאומר. זה מושגת על ידי חשיפת בעלי חיים לסביבות מלחיצות המפעילות מסלולים ספציפיים לחץ הסלולר. כאן, מספר שיטות מסופקות כדי למדוד רגישות של בעלי חיים שלמים לסוגים מסוימים של לחצים.

מתח ER מוחל על C. אלגיה באמצעות הסוכן הכימי, tunicamycin, אשר חוסם את הגליציציה מקושרת N, גרימת הצטברות של חלבונים מקופלים במיון¹⁰. ב -C. אלגיה, הגדילה על החשיפה לטונאיאמיצין גורמת לרטבאליות העיקריים בתפקוד ה-ER, ומפחיתה את תוחלת החיים¹¹באופן משמעותי. על ידי מדידת ההישרדות של בעלי חיים על tunicamycin המכילים צלחות, ER רגישות לחץ של בעלי חיים ניתן לכמת. לדוגמה, בעלי חיים^{עם אינדוקציה} upr חוץ רחמי ובכך התנגדות מוגברת למתח מעוות חלבונים במיון יש הישרדות מוגברת על החשיפה tunicamycin בהשוואה לחיות בר מסוג¹².

לחץ חמצוני ומיטוכונדריאלי מיושם על ידי חשיפת בעלי חיים לסוכן הכימי, paraquat. Paraquat היא בשימוש נפוץ בצמחי מעשה, אשר גורמת היווצרות סופראוקסיד במיוחד המיטו,¹³. בשל הלוקליזציה הספציפי של מינים מסוג חמצן תגובתי (ROS), paraquat בחני משמשים לעתים קרובות בתור “מיטוכונדריאלי” שיטת הסטרס. עם זאת, סופראוקסיד הוא המרה במהירות לתוך תחמוצת מימן על ידי מיטוכונדריזה הסופראוקסיד dismutases (sods)¹⁴. מי חמצן יכול לאחר מכן לפזר מתוך המיטוגרם ולגרום ללחץ חמצוני בתאים אחרים של התא. לכן, אנו מתארים paraquat הישרדות בחני כרגישות מדידה הן מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני (אחר לחץ חמצוני אחרים ניתן למצוא¹⁵).

מאמר התרמוסובלנות מתבצעים באמצעות הצבת בעלי חיים בטמפרטורות גבוהות. טמפרטורת הסביבה לנמטודות הם ~ 15-20 ° c ומתח תרמי מושרה בטמפרטורות מעל 25 ° c^16,17. מערכות התרמוסבילות מבוצעות בדרך כלל בטמפרטורות החל מ-30-37 ° c, כאשר בעלי חיים מפגינים פגמים סלולאריים מרכזיים בטמפרטורה זו, ומספר ההישרדות הושלם בתוך 24 שעות^16,18. כאן מסופקים שתי שיטות חלופיות לביצוע ביצוע: צמיחה ב34 ° c וצמיחה ב-37 ° c. יחד, הפרוטוקולים המוצגים כאן יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסכי בקנה מידה גדול כאשר בשילוב עם הגן הסטנדרטי להפיל באמצעות RNA הפרעות או ספריות תרופות כימיות.

הפרוטוקול יכול להיות מחולק ל -4 הליכים רחבים-צמיחה של C. אלגיה והכנה להדמיה (סעיפים 1 ו-2), הדמיה של כתבים הניתנים להמרה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (סעיפים 3-5), מדידות כמותית של כתבים באמצעות cytometer זרימה גדולה- חלקיק (סעיף 6), והפיזיולוגיה הפיסיולוגית למדידת רגישות

Protocol

1. תנאי צמיחה סטנדרטיים של טמפרטורות & OP50 vs HT115 צמיחה והרחבה סטנדרטית לגדל תרבות של OP50 ליברות (שולחן 1) או מדיה המקבילה של בחירה עבור 24-48 h בטמפרטורת הסביבה (~ 22-25 ° c). לגדול חיידקים בטמפרטורת החדר כמו OP50 הוא מעין מהפך אורציל ו יש שכיחות גבוהה יותר של הגדלות (למשל, מוטציות מדכא) ?…

Representative Results

שימוש בכתבי ההמרה למדידת הפעלת תגובות הסטרסכאן משמשים כתבים בעלי פלורסנט, המשמשים ככלים חזקים למדידת הפעלת רוב תגובות הסטרס בג. ביטוי GFP מונע תחת המקדם של יעדים קאנוניים של מורים מוכווני הבסיס המעורבים בתגובה ללחצים ספציפיים לחלקה. רשימה מקיפה של כתבים ב…

Discussion

כאן, שיטות לחקור תגובות הלחץ הסלולר ב -C. אלגיה, באמצעות כתבים פלורסנט הישרדות הלחץ הפיזיולוגי ההישרדות הפיזי מתוארים. הכתבים כל לנצל את הביטוי GFP מונע תחת היזם של היעד במורד הזרם החוצה של הגורמים שעתוק המעורבים הרכבה התגובות הסלולר. השימוש hsp-4p:: GFP מאופנן על ידי xbp-1s-^{תיווך משנה</sup…}

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	for mitochondrial stress
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118072	for NGM plates
BD Difco granulated agar	VWR	90000-782	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	for RNAi
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	for NGM plates
COPAS Biosorter	Union Biometrica	350-5000-000	equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution	Union Biometrica	300-5072-000	to use with COPAS
COPAS Sheath Solution	Union Biometrica	300-5070-100	to use with COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	solvent for drugs
IPTG dioxane free	Denville Scientific	CI8280-4	for RNAi
LB Broth Miller	Fisher Scientific	BP1426500	for LB
M205FA stereoscope	Leica	10450040	equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-3	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	71289-50G	for imaging
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tert-butyl hydroperoxide	Sigma-Aldrich	458139	for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress