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생물학

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。

Abstract

生物は環境の変動や細胞内恒常性の変化に晒されることが多く、タンパク質や生理学に有害な影響を及ぼす可能性があります。したがって、生物は損傷を修復し、恒常性を維持するために捧げられた標的と特定のストレス応答を進化させてきた。これらのメカニズムには、小胞体の展開されたタンパク質応答(UPRER)、ミトコンドリア(UPRMT)の展開されたタンパク質応答、熱ショック応答(HSR)、酸化ストレス応答(OxSR)が含まれる。ここで示すプロトコルは、線虫、C.エレガンスにおけるこれらの経路の活性化とその生理学的影響を検出し、特徴付ける方法を記述する。まず、経路特異的蛍光転写レポーターの使用について、迅速な細胞特性評価、薬物スクリーニング、または大規模な遺伝子スクリーニング(例えば、RNAiまたは変異型ライブラリー)について説明する。また、相補的で堅牢な生理学的アッセイが記載されており、これは特定のストレッサーに対する動物の感受性を直接評価するために使用することができ、転写記者の機能的検証として役立つ。これらの方法を組み合わせることで、細胞の迅速な特徴付けと、内部および外部のプロテオ毒性摂動の生理的効果を可能にします。

Introduction

生物が細胞内および細胞外環境の変化に対応する能力は、その生存と適応にとって極めて重要である。これは、細胞の完全性を確保する多数の保護経路を介して細胞レベルで達成される。多くの細胞成分がストレス関連の損傷を受ける一方で、細胞ストレス応答の主な関与の1つは、細胞プロテオームの恒常性を修復し、保護することです。しかし、タンパク質をオルガネラと呼ばれる特別な構造に分体化することは、細胞内のすべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、機能することを保証するために、1つの一元化された形態のタンパク質品質管理に頼ることができないため、細胞にとって課題となっています。したがって、タンパク質の摂動に対処するために、オルガネラは、誤って折り畳まれたタンパク質を感知し、そのコンパートメント内のストレスを軽減しようとしてストレス応答を活性化することができる専用の品質管理メカニズムを進化させました。例えば、細胞質は熱ショック応答(HSR)に依存し、小胞体(ER)およびミトコンドリアはコンパートメント特異的に展開されたタンパク質応答(UPR)に依存する。OxSRは活性酸素種(ROS)の毒性作用を緩和する役割を果たす。各ストレス応答は、細胞の課題と環境侮辱の存在下で引き起こされ、調整された転写応答を誘発する。これらの応答の特徴は、適切なオルガネラに標的となる誤って折りたたまれたタンパク質(シャペロンなど)を再折り畳む分子を合成すること、またはタンパク質分解によって損傷したタンパク質を除去することを含む。これらのストレス応答を活性化しないと、損傷したタンパク質の蓄積、細胞機能障害が組織の全身障害に伝播し、最終的には生物の死が生じる。さまざまなストレス応答の機能と調節は、他の場所でレビューされています1.

細胞ストレス応答の調節と活動に関する多くの洞察は、遺伝子研究における多細胞モデル生物である線虫、カエノハブディティス・エレガンスに起因している。線虫は、細胞レベルでのストレス応答の活性化を研究するだけでなく、生物レベルでも研究することができます。線虫は、遺伝的摂動や薬物や汚染物質への暴露が成長と生存に及ぼす影響を研究するために使用されてきました。迅速な生成時間、イソジニー、透明性、遺伝的な難易度、および実験中の使いやすさは、そのような研究に最適です。さらに、ストレスに対する比較的迅速な生理学的反応(数時間から数日の間)と細胞経路の進化的な保全は、線虫をストレス耐性を研究する上で顕著なツールにします。

C.エレガンスを成長させる食料源として使用される2つの一般的に使用される大腸菌株があります:標準OP50、ほとんどの実験が歴史的に行われてきたB株2とHT115、ほぼすべてのRNAi実験3、44に使用されるK-12株。3OP50 と HT115 細菌の食事の間に有意な違いがあることに注意することが重要です。.これらの異なる細菌源の増殖は、代謝プロファイル、ミトコンドリアDNAコピー数、および寿命5を含むいくつかの主要なフェノタイプに大きな違いを引き起こすことが示されている。これらの違いのいくつかは、OP50細菌の増殖に関連するビタミンB12欠乏症に起因し、ミトコンドリア恒常性の欠陥および病原体およびストレスに対する感受性の増加をもたらす可能性がある。これらの現象型のすべては、高レベルのビタミンB126を有するHT115細菌の増殖によって緩和することが示されている。したがって、生理的ストレス応答に関するすべての実験は、RNAi条件の必要性に関係なく、HT115細菌に対して行われることをお勧めします。しかし、OP50上で動物を維持し易いため、ここで説明する実験パラダイムの有意な違いは、OP50上で維持されたワームでは検出されなかったため(すなわち、逮捕または逮捕せずに孵化後の孵化)、全ての標準的な増殖(すなわち、動物の維持および増幅)を行うことができる。

ここで、2つの機能的方法を用いた細胞ストレス応答の活性の特性評価について説明する。提示されるプロトコルは、主に細胞ストレス応答とタンパク質恒常性への影響に焦点を当てていることに留意すべきである。まず、蛍光転写レポーターが利用され、異なる細胞ストレスに応答して特異的に活性化される内因性遺伝子プロモーターによって調節される。これらの蛍光転写レポーターは、ストレス応答のネイティブの一部である特定の遺伝子の転写誘導に基づいています。例えば、HSP-4は、ヒトシャペロンHSPA5/BiPに対する熱ショックタンパク質オルソパチスであり、ER-ストレス時に活性化され、そのストレスを軽減するためにERに局在する。ERストレスの条件(例えば、ツニカマイシンへの曝露)は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、hsp-4プロモーターの調節下に置き、線虫7の大粒子流細胞量を用いて蛍光顕微鏡法または定量的に測定して評価できるように高レベルで合成される。同様に、ミトコンドリアシャペロンのプロモーターは、hsp-6(哺乳動物HSPA9に対するオーソリン)、UPRMT8の活性化を監視するために利用され、そして、細胞質シャペロンhsp-16.2のプロモーター(ヒト結晶性α遺伝子に対する直交性)はHSR9の活性を評価するために使用される。これらのレポーターは、様々な摂動に応答して活性化された経路の迅速な特徴付けを可能にする。

多くの場合、ここで紹介するレポーターは、ストレス応答の活性化の質的な出力を提供する顕微鏡を使用して画像化されます。しかし、イメージング技術は、上記の記者の強度と組織位置の両方に関する情報を提供するが、その定量は必ずしも正確または堅牢ではない。イメージング解析ツールを用いて蛍光活性化を定量することは可能であるが、これらの方法は、比較的低いスループットであり、サンプルサイズが小さいため、画像化された動物の数が比較的少ないことからである。大量の動物を得る容易さと能力は、C.エレガンスを、大きな粒子フローサイトメーターを使用して蛍光ストレスレポーターの活性化をアッセイする理想的なモデルシステムにします。大粒子フローサイトメーターは、多くの生きた動物のサイズと蛍光に基づいて記録、分析、並べ替えが可能です。この方法を使用すると、数千のワームに対する蛍光強度、サイズ、および空間(2D)情報を取得することができます。システムはFlowPilotを使用して制御され、測定されたパラメータのリアルタイムデータ取得および分析が可能になる。ここでは、大粒子流サイトメーターを用いた顕微鏡イメージングと定量分析の両方の方法が、応力応答の活性化を測定する方法として提供されている。

レポーター分析以外にも、動物のストレスに対する感受性や抵抗性は、生理学的ストレスアッセイを用いて測定することができる。これは、特定の細胞ストレス経路を活性化するストレスの多い環境に動物をさらすことによって達成されます。ここでは、特定のタイプのストレッサーに対する全動物の感受性を測定するためのいくつかの方法が提供される。

ERストレスは、化学物質、ツニカマイシンを用いてC.エレガンスに適用され、これはN結合型グリコシル化をブロックし、ER10中に誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積を引き起こす。C.エレガンスでは、チュニカマイシンへの曝露時の成長は、ER機能の大きな摂動をもたらし、寿命11を有意に低下させた。チュニカマイシン含有プレート上の動物の生存率を測定することにより、動物のERストレス感受性を定量化することができる。例えば、異所性UPRER誘導を有する動物は、ERにおけるタンパク質ミスフォールディングストレスに対する耐性が増加し、野生型動物12と比較してチュニカマイシン曝露時の生存率が増加する。

酸化およびミトコンドリアストレスは、化学薬品であるパラコートに動物を曝露することによってC.エレガンスに適用される。パラコートは、一般的に使用される除草剤であり、これはミトコンドリア13で特にスーパーオキシド形成を引き起こす。ミトコンドリア由来の活性酸素種(ROS)の特異的な局在化により、パラコートアッセイは「ミトコンドリア」ストレスアッセイとしてよく使用されます。しかしながら、スーパーオキシドは、ミトコンドリア・スーパーオキシド・ディスムターゼ(SODs)14によって14速やかに過酸化水素に変換される。過酸化水素は、その後、ミトコンドリアから拡散し、細胞の他の区画で酸化ストレスを引き起こす可能性があります。したがって、パラコート生存アッセイは、ミトコンドリアと酸化ストレスの両方に対する感受性を測定すると説明する(他の酸化ストレスアッセイは15を見つけることができる)。

耐熱アッセイは、高温で動物を配置することによってC.エレガンスで行われます。線虫の周囲温度は~15~20°Cで、熱応力は25°C16,17,17以上の温度で誘発される。耐熱アッセイは、一般に、30〜37°Cの範囲の温度で行われ、動物はこの温度で大きな細胞欠陥を示し、生存アッセイは24時間16、18,18時間以内に完了する。ここでは、耐熱性アッセイを行うための2つの代替方法が提供されています:34°Cでの成長と37°Cでの成長。RNA干渉または化学薬物ライブラリーを用いて、標準遺伝子のノックダウンと組み合わせると、ここで提示されるプロトコルを利用して、大規模スクリーンを実行することができます。

このプロトコルは、C.エレガンスの成長とイメージングの準備(セクション1および2)、蛍光顕微鏡(セクション3〜5)を用いた転写記者のイメージング、大粒子流サイトメーター(セクション6)を用いた記者の定量測定、およびC.エレガンスのストレス感受性を測定する生理学的アッセイ(セクション7)の4つの広範な手順に分けることができる。

Protocol

1. 温度の標準的な成長条件 & OP50 対 HT115 標準の成長と拡大 OP50の培養物をLB(表1)または周囲温度(〜22〜25°C)で24〜48時間の場合に選択した同等の培地で成長させます。OP50として室温で細菌を成長させるのはウラシル・オーソストロフであり、37°Cで増殖した場合の戻り物(例えば、サプレッサー変異体)の発生率が高い。OP50培養物の長期保存は推奨されません(4°Cで最大1…

Representative Results

転写レポーターを使用したストレス応答の活性化測定ここでは、蛍光転写レポーターが使用され、C.エレガンスのほとんどのストレス応答の活性化を測定するための堅牢なツールとして機能します。GFP発現は、コンパートメント固有のストレスへの対応に関与するマスター転写調節因子の正規標的のプロモーターの下で駆動される。一般的に使?…

Discussion

ここでは、C.エレガンスにおける細胞ストレス応答を問い込む方法、蛍光転写レポーターおよび生理学的ストレス生存アッセイを用いて説明する。レポーターは、細胞ストレス応答の取り付けに関与する転写因子の下流転写標的のプロモーターの下で駆動されるGFP発現を利用する。Hsp-4p::GFPは、XBP-1s媒介UPRERによって変調され、hsp-6p::GFPはATFS-1媒介UPRMTによ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ。EMBO長期フェローシップとラリー・L・ヒルブロム財団の支援を受けています。R.H.Sは、国立老化研究所(NIA)とグレン医学研究博士研究員財団を通じて5F32AG032023-02を助成金で支えています。A.F.は、NIAを通じてF32AG051355を付与することによってサポートされています。H.K.G.は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムを通じて、DGE1752814の助成金によって支援されています。M.G.M.は1F31AG060660-01からNIAまでサポートされています。A.D.はトーマスとステイシー・シーベル財団、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIAから4R01AG042679-04および5R01AG05891-02、およびNIEHSから5R01ES021667-09によってサポートされています。ラリー・ジョー、メリッサ・サンチェス、ナーメ・ケレット、アネル・エスキベルに対し、重要な技術支援をよろしくお願いします。私たちは、モリモト研究所とCGC(研究インフラプログラムP40 OD010440のNIH事務局が出資)に対して、株に感謝します。

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
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Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
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