Измерения физиологических стрессовых реакций у C. Elegans

Summary

Здесь мы характеризуем клеточные протеотоксические реакции стресса в нематоде C. elegans путем измерения активации флуоресцентных транскрипционных репортеров и просказа чувствительности к физиологическому стрессу.

Abstract

Организмы часто подвергаются колебаниям среды и изменения внутриклеточного гомеостаза, которые могут иметь пагубные последствия для их протеома и физиологии. Таким образом, организмы развивались целенаправленные и конкретные реакции стресса, посвященный ремонту повреждений и поддерживать гомеостаз. Эти механизмы включают в себя развернутую реакцию белка эндоплазмического ретикулума (UPR^ER),развернутую белковую реакцию митохондрий (UPR^MT),реакцию теплового шока (HSR) и окислительную реакцию стресса (OxSR). Представленные здесь протоколы описывают методы обнаружения и характеристики активации этих путей и их физиологических последствий в нематоде, C. elegans. Во-первых, использование флуоресцентных транскрипционных репортеров, специфичных для использования в пути, описывается для быстрой клеточной характеристики, скрининга наркотиков или крупномасштабного генетического скрининга (например, библиотеки РНК или мутантов). Кроме того, описаны дополнительные, надежные физиологические анализы, которые могут быть использованы для непосредственной оценки чувствительности животных к конкретным стрессорам, служа функциональной проверкой транскрипционных репортеров. Вместе эти методы позволяют быстро охарактеризовать клеточные и физиологические эффекты внутренних и внешних протеотоксических возмущений.

Introduction

Способность организма реагировать на изменения внутри- и внеклеточной среды имеет решающее значение для его выживания и адаптации. Это достигается на клеточном уровне через многочисленные защитные пути, которые обеспечивают целостность клетки. В то время как многочисленные клеточные компоненты подвержены стресс-ассоциированных повреждений, одним из основных участие клеточных реакций стресса является ремонт и защита гомеостаза клеточного протеома. Тем не менее, разобщенство белков в специальные структуры, называемые органеллами, представляет собой проблему для клетки, так как она не может полагаться на одну централизованную форму контроля качества белка, чтобы гарантировать, что все белки в клетке правильно сложены и функциональны. Поэтому, чтобы справиться с возмущениями к их белкам, органеллы развили специальные механизмы контроля качества, которые могут чувствовать неправильно сложенные белки и активировать стресс ответ в попытке облегчить стресс в этом отсеке. Например, цитозол опирается на реакцию теплового шока (HSR), в то время как эндоплазмический ретикулум (ER) и митохондрии полагаются на их отсек конкретных развернутых белковых реакций (UPR). OxSR служит для облегчения токсического воздействия реактивных видов кислорода (ROS). Каждый стресс ответ вызывается в присутствии сотовых проблем и экологических оскорблений и вызывает индивидуальный транскрипционный ответ. Отличительными чертами этих ответов являются синтез молекулы, которые повторно складываются неправильно сложенные белки (например, сопровождающие), предназначенные для надлежащей органеллы, или же, удалить поврежденные белки путем деградации белка. Неспособность активировать эти стрессовые реакции приводит к накоплению поврежденных белков, клеточной дисфункции, распространяемых на системный отказ тканей, и в конечном итоге смерти организма. Функция и регулирование различных ответов на стресс рассматриваются в другом месте¹.

Многие идеи в отношении регулирования и активности клеточных реакций стресса были отнесены к нематод, Caenorhabditis elegans, многоклеточной модели организма в генетических исследованиях. Нематоды позволяют изучать активацию стрессовых реакций не только на клеточном уровне, но и на уровне организма; нематод были использованы для изучения влияния генетических возмущений или воздействия наркотиков и загрязняющих веществ на их рост и выживание. Их быстрое время генерации, изогенность, прозрачность, генетическая уступчивость и простота использования во время экспериментов делают их идеальными для таких исследований. Кроме того, относительно быстрая физиологическая реакция на стресс (между часами и несколькими днями) и эволюционное сохранение клеточных путей делают нематоды выдающимся инструментом в изучении стрессоустойчивости.

Есть два широко используемых штаммов кишечной палочки, используемых в качестве источника пищи для выращивания C. elegans: стандартный OP50, штамм B, в котором большинство экспериментов было исторически выполнено² и HT115, штамм K-12, который используется почти для всех экспериментов РНК^3,4. Важно отметить, что существуют значительные различия между OP50 и HT115 бактериальных диет. Рост на этих различных бактериальных источников было показано, что причиной серьезных различий в метаболических профиля, митохондриальной КОПИи днк номер, и несколько основных фенотипов, в том числе продолжительность жизни⁵. Некоторые из этих различий объясняются дефицитом витамина В12, связанным с ростом бактерий OP50, что может привести к дефектам митохондриального гомеостаза и повышенной чувствительности к патогенам и стрессам. Все эти фенотипы, как было показано, были смягчены ростом на HT115 бактерий, которые имеют более высокий уровень витамина B12⁶. Поэтому рекомендуется проводить все эксперименты по физиологическим стрессовым реакциям на бактериях HT115, независимо от необходимости РНК. Однако, из-за простоты поддержания животных на OP50, весь стандартный рост (т.е. обслуживание и усиление животных) может быть выполнен на OP50, так как значительные различия в экспериментальных парадигмах, описанных здесь, не были обнаружены у червей, поддерживаемых на OP50 до тех пор, пока они не были перенесены на HT115 пост синхронизации (т.е. от люка после отбеливания с или не-ареста).

Здесь описана характеристика активности клеточных стрессовых реакций с использованием двух функциональных методов. Следует отметить, что представленные протоколы в первую очередь ориентированы на клеточные реакции стресса и их влияние на белок гомеостаза. Во-первых, используются флуоресцентные транскрипционные репортеры, которые регулируются эндогенными генными промоутерами, которые специально активируются в ответ на различные клеточные стрессы. Эти флуоресцентные транскрипционные репортеры основаны на транскрипционной индукции конкретных генов, которые являются родным и частью реакции на стресс. Например, HSP-4, белок теплового шока orthologous для человека сопровождающего HSPA5/BiP, активируется на ER-стресс и локализуется в ER, чтобы облегчить стресс. В условиях стресса ER (например, воздействие туникамицина), зеленый флуоресцентный белок (GFP), помещенный под регулирование hsp-4 промотор, синтезируется в высоких уровнях, как может быть оцененфлоесцентной микроскопии или количественно измеряется с помощью крупночастицного потока цитометрии нематод⁷. Аналогичным образом, промоутер митохондриального сопровождающего, hsp-6 (ортологос для млекопитающих HSPA9), используется для мониторинга активации UPR^MT8, и промоутер цитосоликического сопровождающего hsp-16.2 (ортолологос того к кристаллическому альфа-генам человека) используется для оценки активности HSR⁹. Эти репортеры позволяют быстро охарактеризовать пути, активированные в ответ на различные возмущения.

Часто представленные здесь репортеры изображены с помощью микроскопии, которая обеспечивает качественный выход активации стрессовых реакций. Однако, хотя методы визуализации предоставляют как информацию об интенсивности, так и местонахождении тканей репортеров, описанных выше, ее количественная оценка не всегда является точной или надежной. Хотя можно количественно флуоресцентной активации с помощью инструментов анализа изображений, эти методы являются относительно низкой пропускной всей и размер выборки невелик, из-за относительно низкого числа животных изображения. Легкость и способность получать большое количество животных быстро делают C. elegans идеальной модельной системой для того чтобы рассказать активацию флуоресцентных репортеров усилия через использование цитометра потока больших частиц. Цитометр потока больших частиц способен регистрировать, анализировать и сортировать на основе размера и флуоресценции от многих живых животных. Используя этот метод, можно получить флуоресцентную интенсивность, размер, а также пространственную (2D) информацию для тысяч червей. Система управляется с помощью FlowPilot, что позволяет в режиме реального времени получать и анализировать измеренные параметры. Здесь в качестве методов измерения активации стрессовых реакций предлагаются методы как микроскопической визуализации, так и количественного анализа с использованием цитметра потока больших частиц.

Помимо анализа репортера, чувствительность или устойчивость животных к стрессу может быть измерена с помощью физиологических анализов стресса. Это достигается путем воздействия животных на стрессовых средах, которые активируют конкретные клеточные пути стресса. Здесь предусмотрено несколько методов измерения чувствительности целых животных к определенным видам стрессоров.

ER стресс применяется к C. elegans с помощью химического агента, туникамицина, который блокирует N-связанных гликозилирования, вызывая накопление неправильно сложенных белков в ER¹⁰. В C. elegans, рост при воздействии туникамицина приводит к серьезным возмущениям в функции ER, и значительно сократилась продолжительность жизни¹¹. Путем измерять выживание животных на туникамицин-содержащих плитах, чувствительность усилия ER может быть измерять. Например, животные с внематочной индукцией UPR^ER и, таким образом, повышенной устойчивостью к воздействию белка неправильно горит в ER, имеют повышенную выживаемость при воздействии туникамицина по сравнению с дикими животными^{типа 12.}

Оксидативный и митохондриальный стресс применяется к C. elegans, подвергая животных химическому агенту, параквату. Паракват является широко используемым гербицидом, который вызывает образование супероксида специально в митохондриях^13. В связи с конкретной локализацией митохондрий полученных реактивных видов кислорода (ROS), паркватные анализы часто используются в качестве “митохондриального” стресс-анализ. Тем не менее, супероксид быстро преобразуется в перекись водорода митохондриальной супероксид дисмутазы (SODs)¹⁴. Перекись водорода может впоследствии диффундии из митохондрий и вызвать окислительный стресс в других отсеках клетки. Таким образом, мы описываем паракват выживания анализы как измерение чувствительности как к митохондриальной и окислительного стресса (другие окислительные стрессы анализы можно найти¹⁵).

Термотерпимость анализы выполняются в C. elegans путем размещения животных в повышенной температуре. Температура нематод температуры нематод составляет 15-20 градусов по Цельсию, а тепловой стресс индуцируется при температурах выше 25 градусов по Цельсию^16,17. Термотерпимость анализы, как правило, выполняются при температурах, начиная от 30-37 градусов по Цельсию, как животные проявляют основные клеточные дефекты при такой температуре, и выживание анализы завершены в течение 24 часов^16,18. Здесь предусмотрены два альтернативных метода для проведения термопереносимости анализов: рост при 34 градусах Цельсия и рост при 37 градусах Цельсия. Вместе, протоколы, представленные здесь могут быть использованы для выполнения крупномасштабных экранов в сочетании со стандартным геном нокдаун с помощью РНК-помех или химических библиотек наркотиков.

Протокол может быть разбит на 4 широкие процедуры – рост C. elegans и подготовка к визуализации (разделы 1 и 2), визуализация транскрипционных репортеров с использованием флуоресцентной микроскопии (раздел 3-5), количественные измерения репортеров с использованием китометра потока больших частиц (раздел 6), и физиологические анализы для измерения чувствительности к стрессу в C. elegans (раздел 7).

Protocol

1. Стандартные условия роста температур ы и OP50 против HT115 Стандартный рост и расширение Выращивайте культуру OP50 в LB(таблица 1)или эквивалентные носители выбора для 24-48 ч при температуре окружающей среды (22-25 градусов по Цельсию). Выращивайте бактерии при комнатной темпе…

Representative Results

Использование транскрипционных репортеров для измерения активации стрессовых реакцийЗдесь используются флуоресцентные транскрипционные репортеры, которые служат надежными инструментами для измерения активации большинства стрессовых реакций в C. elega…

Discussion

Здесь описаны методы для изучения клеточных реакций стресса в C. elegans,с помощью флуоресцентных транскрипционных репортеров и физиологических анализов выживания стресса. Репортеры все используют выражение GFP приводом под промоутер вниз по течению транскрипционной цели транскрипц…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	for mitochondrial stress
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118072	for NGM plates
BD Difco granulated agar	VWR	90000-782	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	for RNAi
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	for NGM plates
COPAS Biosorter	Union Biometrica	350-5000-000	equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution	Union Biometrica	300-5072-000	to use with COPAS
COPAS Sheath Solution	Union Biometrica	300-5070-100	to use with COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	solvent for drugs
IPTG dioxane free	Denville Scientific	CI8280-4	for RNAi
LB Broth Miller	Fisher Scientific	BP1426500	for LB
M205FA stereoscope	Leica	10450040	equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-3	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	71289-50G	for imaging
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tert-butyl hydroperoxide	Sigma-Aldrich	458139	for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress