Mätningar av fysiologiska stressreaktioner i C. Elegans

Summary

Här karakteriserar vi cellulära proteotoxiska stresssvar i nematoden C. elegans genom att mäta aktiveringen av fluorescerande transkriptionella reportrar och analysera känslighet för fysiologisk stress.

Abstract

Organismer utsätts ofta för fluktuerande miljöer och förändringar i intracellulära homeostas, vilket kan ha skadliga effekter på deras proteom och fysiologi. Således har organismer utvecklats riktade och specifika stressreaktioner avsedda för att reparera skador och upprätthålla homeostas. Dessa mekanismer inkluderar det ovikta proteinsvaret hos den endoplasmatiska reticulum (UPR^ER),mitokondriernas (UPR^MT)utvecklade proteinrespons (HSR) och oxidativstressrespons (OxSR). De protokoll som presenteras här beskriver metoder för att upptäcka och karakterisera aktiveringen av dessa vägar och deras fysiologiska konsekvenser i nematoden, C. elegans. För det första beskrivs användningen av pathway-specifika fluorescerande transkriptionella reportrar för snabb cellulär karakterisering, läkemedelsscreening eller storskalig genetisk screening (t.ex. RNAi eller mutantbibliotek). Dessutom beskrivs kompletterande, robusta fysiologiska analyser, som kan användas för att direkt bedöma djurens känslighet för specifika stressfaktorer, vilket fungerar som funktionell validering av de transkriptionsreportrar. Tillsammans möjliggör dessa metoder snabb karakterisering av de cellulära och fysiologiska effekterna av interna och externa proteotoxiska störningar.

Introduction

En organisms förmåga att reagera på förändringar i den intra- och extracellulära miljön är avgörande för dess överlevnad och anpassning. Detta sker på cellnivå genom många skyddande vägar som säkerställer integriteten i cellen. Medan många cellulära komponenter är föremål för stress-associerade skador, en stor inblandning av cellulära stress svar är att reparera och skydda homeostas av cellulära proteom. Men uppdelningen av proteiner i speciella strukturer, som kallas organeller, utgör en utmaning för cellen, eftersom den inte kan förlita sig på en centraliserad form av proteinkvalitetskontroll för att säkerställa att alla proteiner i cellen är ordentligt vikta och funktionella. Därför, för att hantera störningar i sina proteiner, organeller har utvecklats dedikerade mekanismer för kvalitetskontroll, som kan känna felvikta proteiner och aktivera en stressrespons i ett försök att lindra stress inom detta utrymme. Cytosolen förlitar sig till exempel på värmechocksvaret (HSR), medan det endoplasmatiska reticulum (ER) och mitokondrierna förlitar sig på sina fackspecifika ovikta proteinsvar (UPR). OxSR tjänar till att lindra de toxiska effekterna av reaktiva syrearter (ROS). Varje stressrespons utlöses i närvaro av cellulära utmaningar och miljöföreskrifter och inducerar ett skräddarsytt transkriptionellt svar. Kännetecknen för dessa svar inkluderar syntetiserande molekyler som åter vika felvikta proteiner (såsom förkläde) riktade till rätt organell, eller alternativt ta bort skadade proteiner genom proteinnedbrytning. Underlåtenhet att aktivera dessa stressreaktioner resulterar i ansamling av skadade proteiner, cellulär dysfunktion förökas till systemisk fel i vävnader, och så småningom död av organismen. Funktionen och regleringen av de olika stressreaktionerna ses över någon annanstans¹.

Många insikter om reglering och aktivitet av cellulära stressreaktioner har tillskrivits nematoden, Caenorhabditis elegans, en flercellig modell organism i genetisk forskning. Nematoder tillåter inte bara att studera aktivering av stressreaktioner på cellnivå, men också på organismnivå; nematoder har använts för att studera effekterna av genetiska störningar eller exponering för läkemedel och föroreningar på deras tillväxt och överlevnad. Deras snabba generationstid, isogeny, öppenhet, genetisk tractability, och användarvänlighet under experiment gör dem idealiska för sådana studier. Dessutom, den relativt snabba fysiologiska svar på stress (mellan timmar och några dagar) och den evolutionära bevarande av cellulära vägar gör nematoder ett framträdande verktyg för att studera stresstålighet.

Det finns två vanliga E. coli stammar som används som en näringskälla för att odla C. elegans:standard OP50, en B-stam där de flesta experiment har historiskt utförts² och HT115, en K-12 stam som används för nästan alla RNAi experiment^3,4. Det är viktigt att notera att det finns betydande skillnader mellan OP50 och HT115 bakteriell kost. Tillväxt på dessa olika bakteriella källor har visat sig orsaka stora skillnader i metabolisk profil, mitokondriellt DNA-kopieringsnummer, och flera stora fenotyper, inklusive livslängd⁵. Några av dessa skillnader tillskrivs vitamin B12 brist i samband med tillväxt på OP50 bakterier, vilket kan resultera i defekter i mitokondriell homeostas och ökad känslighet för patogener och påfrestningar. Alla dessa fenotyper har visat sig lindras genom tillväxt på HT115 bakterier, som har högre nivåer av vitamin B12⁶. Därför rekommenderas att alla experiment på fysiologiska stressreaktioner utförs på HT115-bakterier, oavsett nödvändigheten av RNAi-tillstånd. På grund av att djuren är lätta att underhålla op50 kan dock all standardtillväxt (dvs. underhåll och förstärkning av djur) utföras på OP50, eftersom betydande skillnader i de experimentella paradigm som beskrivs här inte upptäcktes i maskar som upprätthålls på OP50 så länge de flyttades till HT115 efter synkronisering (dvs. från kläckning efter blekning med eller utan L1 gripande) fram till experiment.

Här beskrivs karakteriseringen av aktiviteten hos cellulära stressreaktioner med hjälp av två funktionella metoder. Det bör noteras att de protokoll som presenteras är främst inriktade på cellulära stressreaktioner och deras inverkan på protein homeostas. Först används fluorescerande transkriptionsreportrar, som regleras av endogena genpromotorer som är specifikt aktiverade som svar på olika cellulära påfrestningar. Dessa fluorescerande transkriptionella reportrar är baserade på transkriptionell induktion av specifika gener som är inbyggt en del av stressresponsen. Till exempel, HSP-4, en värmechock protein orthologous till den mänskliga förkläde HSPA5/BiP, aktiveras vid ER-stress och lokaliserar till ER för att lindra stress. Under förhållanden av ER-stress (t.ex. syntetiseras exponering för tunicamycin), ett grönt fluorescerande protein (GFP), som placeras enligt hsp-4-promotorns reglering, i höga nivåer som kan bedömas genom fluorescerande mikroskopi eller kvantitativt mätas med hjälp av stor partikelflödescytometri av nematoder⁷. På samma sätt används promotorn för ett mitokondriellt förkläde, hsp-6 (ortos till däggdjurs-HSPA9), för att övervaka aktiveringen av UPR^MT8, och promotorn av cytosolic förkläde hsp-16,2 (ortos till de mänskliga crystallin alfagener) används för att bedöma aktiviteten hos HSR⁹. Dessa reportrar möjliggör en snabb karakterisering av de vägar som aktiveras som svar på olika störningar.

Ofta är de reportrar som presenteras här avbildade med hjälp av mikroskopi, vilket ger en kvalitativ effekt av aktivering av stressreaktioner. Men medan bildframställning tekniker ger både information om intensitet och vävnad plats för reportrar som beskrivs ovan, är dess kvantifiering inte alltid korrekt eller robust. Även om det är möjligt att kvantifiera fluorescerande aktivering med hjälp av bildanalysverktyg, är dessa metoder relativt låga genomströmning och provstorleken är liten, på grund av det relativt låga antalet avbildade djur. Den lätthet och förmåga att få stora mängder djur snabbt göra C. elegans en idealisk modell system för att analysera aktivering av fluorescerande stress reportrar med hjälp av en stor partikel flöde cytometer. En stor partikelflödescytmeter kan registrera, analysera och sortera baserat på storlek och fluorescens från många levande djur. Med den här metoden är det möjligt att få fluorescerande intensitet, storlek och även rumslig (2D) information för tusentals maskar. Systemet styrs med FlowPilot, vilket möjliggör datainsamling och analys i realtid av de uppmätta parametrarna. Här erbjuds metoder för både mikroskopisk avbildning och kvantitativ analys med hjälp av en stor partikelflödescytometer som metoder för att mäta aktivering av stressreaktioner.

Utöver reporteranalys kan djurens känslighet eller motståndskraft mot stress mätas med hjälp av fysiologiska stressanalyser. Detta uppnås genom att utsätta djur för stressiga miljöer som aktiverar specifika cellulära stressvägar. Här finns flera metoder för att mäta hela djurs känslighet för specifika typer av stressfaktorer.

ER stress appliceras på C. elegans med hjälp av det kemiska medlet, tunicamycin, som blockerar N-linked glykosylering, orsakar ansamling av felvikta proteiner i ER¹⁰. I C. elegans, tillväxt vid exponering för tunicamycin resulterar i stora störningar i ER funktion, och en betydligt minskad livslängd¹¹. Genom att mäta djurens överlevnad på tunicamycinhaltiga plattor kan ER-stresskänsligheten hos djur kvantifieras. Till exempel, djur med ectopic UPR^ER induktion och därmed ökad motståndskraft mot protein felvikning stress i ER har en ökad överlevnad vid tunicamycin exponering jämfört med vilda djur¹².

Oxidativ och mitokondriell stress appliceras på C. elegans genom att utsätta djur för det kemiska medlet, parakvat. Parakvat är en vanligt förekommande herbicid, som orsakar superoxid bildning specifikt i mitokondrierna¹³. På grund av den specifika lokaliseringen av mitokondrierna-härledda reaktiva syrearter (ROS), parakvat analyser används ofta som en “mitokondriell” stressanalys. Superoxid omvandlas dock snabbt till väteperoxid genom mitokondriell superoxiddismutaser (SODs)¹⁴. Väteperoxid kan därefter sprida sig ur mitokondrierna och orsaka oxidativ stress i andra delar av cellen. Därför beskriver vi parakvat överlevnadsanalyser som mätkänslighet för både mitokondriell och oxidativ stress (andra oxidativa stressanalyser kan hittas¹⁵).

Termotolerance analyser utförs i C. elegans genom att placera djur i förhöjda temperaturer. Omgivningstemperaturen för nematoder är ~15-20 °C och termisk stress framkallas vid temperaturer över 25 °C^16,17. Termotolerance analyser utförs i allmänhet vid temperaturer från 30-37 °C, eftersom djur uppvisar stora cellulära defekter vid denna temperatur, och överlevnadsanalyser slutförs inom 24 timmar^16,18. Här finns två alternativa metoder för att utföra termotoleranceanalyser: tillväxt vid 34 °C och tillväxt vid 37 °C. Tillsammans kan de protokoll som presenteras här användas för att utföra storskaliga skärmar i kombination med standardgen knock-down med RNA-interferens eller kemiska läkemedelsbibliotek.

Protokollet kan delas upp i 4 breda förfaranden- tillväxt av C. elegans och förberedelse för bildbehandling (avsnitt 1 och 2), avbildning av transkriptionella reportrar med fluorescerande mikroskopi (avsnitt 3-5), kvantitativa mätningar av reportrar med hjälp av en stor partikelflödescytometer (avsnitt 6) och fysiologiska analyser för att mäta stresskänslighet i C. elegans (avsnitt 7).

Protocol

1. Standardtillväxtförhållanden för temperaturer och OP50 vs HT115 Standardtillväxt och expansion Odla en odling av OP50 i LB(tabell 1)eller motsvarande media val för 24-48 h vid rumstemperatur (~ 22-25 °C). Odla bakterier i rumstemperatur eftersom OP50 är en uracil auxotroph och det finns en högre incidens av revertants (t.ex. suppressor mutanter) när de odlas vid 37 °C. Långtidslagring av OP50-kulturer rekommenderas inte (max 1 vecka vid 4 °C). Sådd en volym a…

Representative Results

Använda transkriptionella reportrar för att mäta aktivering av stressreaktionerHär används fluorescerande transkriptionsreportrar, som fungerar som robusta verktyg för att mäta aktivering av de flesta stressreaktioner i C. elegans. GFP-uttrycket drivs under initiativtagare till kanoniska mål för master transkriptionella tillsynsmyndigheter som arbetar med att reagera på fackspecifika påfrestningar. En omfattande förteckning över vanliga transkrip…

Discussion

Här beskrivs metoder för att förhöra cellulära stressreaktioner i C. elegans– med hjälp av fluorescerande transkriptionsreportrar och fysiologiska stressöverlevnadsanalyser. Reportrarna använder alla GFP uttryck drivs under initiativtagare till en nedströms transkriptionella mål för transkription faktorer som är inblandade i montering cellulära stressreaktioner. Användningen av hsp-4p::GFP moduleras av XBP-1s-medierad UPR^ER, hsp-6p::GFP kontrolleras av ATFS-1-medierad…

Materials

Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	for mitochondrial stress
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118072	for NGM plates
BD Difco granulated agar	VWR	90000-782	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	BioPioneer	C0051-25	for RNAi
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	for NGM plates
COPAS Biosorter	Union Biometrica	350-5000-000	equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution	Union Biometrica	300-5072-000	to use with COPAS
COPAS Sheath Solution	Union Biometrica	300-5070-100	to use with COPAS
DMSO	Sigma-Aldrich	472301	solvent for drugs
IPTG dioxane free	Denville Scientific	CI8280-4	for RNAi
LB Broth Miller	Fisher Scientific	BP1426500	for LB
M205FA stereoscope	Leica	10450040	equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-3	for NGM plates, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Revolve	ECHO	75990-514	equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	71289-50G	for imaging
Sodium Chloride	EMD Millipore	SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tert-butyl hydroperoxide	Sigma-Aldrich	458139	for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	T7660-5G	for RNAi
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	for ER stress