JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61001
, , , , , , ,
1Department of Molecular and Cell Biology,University of California, Berkeley

Summary

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

Abstract

Organizmalar genellikle dalgalanan ortamlara ve hücre içi homeostazdeğişikliklerine maruz kalırlar, bu da proteom ve fizyolojileri üzerinde zararlı etkilere yol açabilir. Böylece, organizmalar hasar onarmak ve homeostaz korumak için adanmış hedefli ve özel stres yanıtları gelişti. Bu mekanizmalar arasında endoplazmik retikulum (UPRER),mitokondri (UPRMT),ısı şoku yanıtı (HSR) ve oksidatif stres tepkisinin (OxSR) ortaya çıkan protein yanıtı yer almaktadır. Burada sunulan protokoller, bu yolların aktivasyonunu ve bunların nematod, C. elegans’takifizyolojik sonuçlarını tespit etme ve karakterize etme yöntemlerini tanımlar. İlk olarak, hızlı hücresel karakterizasyon, ilaç taraması veya büyük ölçekli genetik tarama (örneğin, RNAi veya mutant kütüphaneler) için yola özgü floresan transkripsiyonel muhabirlerin kullanımı açıklanmıştır. Buna ek olarak, tamamlayıcı, sağlam fizyolojik tahliller açıklanmıştır, hangi doğrudan belirli stres hayvanların duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir, transkripsiyonel muhabirlerin fonksiyonel doğrulama olarak hizmet vermektedir. Birlikte, bu yöntemler iç ve dış proteotoksik pertürbations hücresel ve fizyolojik etkileri hızlı karakterizasyonu için izin verir.

Introduction

Bir organizmanın hücre içi ve hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt verebilme yeteneği hayatta kalması ve adaptasyonu için çok önemlidir. Bu hücre bütünlüğünü sağlamak çok sayıda koruyucu yollar aracılığıyla hücresel düzeyde gerçekleştirilir. Çok sayıda hücresel bileşenler stresle ilişkili hasara maruz kalırken, hücresel stres yanıtlarının önemli bir tutulumu hücresel proteomun homeostazını onarmak ve korumaktır. Ancak, proteinlerin organel adı verilen özel yapılara bölünmesi, hücre içindeki tüm proteinlerin düzgün bir şekilde katlanıp işlevsel olmasını sağlamak için merkezi bir protein kalite kontrolü formuna güvenemeyeceği nden, hücre için bir sorun teşkil etmektedir. Bu nedenle, proteinleri için tedirginlikile başa çıkmak için, organeller yanlış katlanmış proteinleri algılamak ve bu bölme içinde stresi hafifletmek için bir girişim bir stres yanıtı etkinleştirmek özel kalite kontrol mekanizmaları, gelişti. Örneğin, sitosol ısı şoku tepkisine (HSR) dayanırken, endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondriler kompartmana özgü açılmakta olan protein yanıtlarına (UPR) güvenirler. OxSR reaktif oksijen türlerinin toksik etkilerini hafifletmek için hizmet vermektedir (ROS). Her stres tepkisi hücresel sorunlar ve çevresel hakaretvarlığında tetiklenir ve özel bir transkripsiyonel tepki neden olur. Bu yanıtların ayırıcı özellikleri, yanlış katlanmış proteinleri (şaperonlar gibi) uygun organelle yeniden katlayan veya alternatif olarak protein yıkımı ile hasarlı proteinleri ortadan kaldıran moleküllerin sentezlemesidir. Bu stres yanıtlarının etkinleştirilmesinin sağlanamaması hasarlı proteinlerin birikmesine, dokuların sistemik yetmezliğine yayılan hücresel disfonksiyona ve sonunda organizmanın ölümüne yol açar. Farklı stres yanıtlarının işlevi ve düzenlenmesi başka bir yerde gözden geçirilir1.

Hücresel stres yanıtlarının düzenlenmesi ve aktivitesi ile ilgili birçok anlayışlar nematod atfedilmiştir, Caenorhabditis elegans, genetik araştırmalarda çok hücreli model organizma. Nematodlar sadece hücredüzeyinde stres yanıtlarının aktivasyonçalışmasına izin değil, aynı zamanda organizma düzeyinde; nematodlar genetik tedirginliklerin veya ilaçlara ve kirleticilere maruz kalmanın büyüme ve hayatta kalma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Onların hızlı nesil zaman, izojeni, şeffaflık, genetik sistemlilik, ve deneme sırasında kullanım kolaylığı onları bu tür çalışmalar için ideal olun. Ayrıca, strese nispeten hızlı fizyolojik tepki (saat ve birkaç gün arasında) ve hücresel yolların evrimsel korunması nematodlar stres direnci çalışmalarında önemli bir araç olun.

C. elegansbüyümek için bir besin kaynağı olarak kullanılan iki yaygın olarak kullanılan E. coli suşları vardır: standart OP50, hangi en deney tarihsel2 ve HT115, hemen hemen tüm RNAi deneyleri için kullanılan bir K-12 suşu yapılmıştır bir B suşu3,4. OP50 ve HT115 bakteriyel diyetler arasında önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Bu farklı bakteriyel kaynaklarda büyüme metabolik profil, mitokondriyal DNA kopya numarası ve yaşam süresi5de dahil olmak üzere birçok önemli fenotipler, önemli farklılıklara neden olduğu gösterilmiştir . Bu farklılıkların bazıları OP50 bakteri büyüme ile ilişkili Vitamin B12 eksikliği atfedilir, mitokondriyal homeostaz kusurları ve patojenler ve streslere karşı artan duyarlılık neden olabilir. Tüm bu fenotiplerin HT115 bakterisi üzerinde büyüme ile hafifletilmiş olduğu gösterilmiştir, Hangi B12 vitamini daha yüksek düzeyde var6. Bu nedenle, rnai koşullarının gerekliliğine bakılmaksızın HT115 bakterileri üzerinde fizyolojik stres yanıtları üzerinde tüm deneylerin yapılması tavsiye edilir. Ancak, OP50’de hayvanların bakım kolaylığı nedeniyle, tüm standart büyüme (yani hayvanların bakımı ve amplifikasyonu) OP50 üzerinde gerçekleştirilebilir, çünkü burada açıklanan deneysel paradigmalarda önemli farklılıklar saptanamamıştır, op50’de tutulan solucanlarda, ht115 sonrası senkronizasyona (yani, l1 tutuklaması ile veya l1 tutuklaması olmadan yumurta dan beyazlatma dan) geçirilmelerinden itibaren fark edilmemiştir.

Burada iki fonksiyonel yöntem kullanılarak hücresel stres yanıtlarının aktivitesinin karakterizasyonu açıklanmıştır. Bu protokoller sunulan öncelikle hücresel stres yanıtları ve protein homeostaz üzerindeki etkileri üzerinde duruldu unutulmamalıdır. İlk olarak, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılmaktadır, hangi özellikle farklı hücresel streslere yanıt olarak aktive endojen gen organizatörleri tarafından düzenlenir. Bu floresan transkripsiyonel muhabirler, stres yanıtının doğal olarak bir parçası olan spesifik genlerin transkripsiyonel indüksiyonuna dayanmaktadır. Örneğin, HSP-4, insan refakatçih HSPA5/BiP bir ısı şok proteinorolog, ER-stres üzerine aktive edilir ve stresi hafifletmek için ER lokalize. ER stres koşullarında (örneğin, tunicamycin maruz imal), yeşil floresan protein (GFP), hsp-4 organizatörü nyönetmeliği altında yer, floresan mikroskopisi ile değerlendirilebilir veya kantitatif nematodların büyük parçacık akış sitometri kullanılarak ölçülebilir yüksek seviyelerde sentezlenir7. Benzer şekilde, bir mitokondriyal şaperon organizatörü, hsp-6 (memeli HSPA9 ortologous), UPRMT8aktivasyonunu izlemek için kullanılır , ve sitosolik şaperon organizatörü-16.2 (insan kristalin alfa genlerine ortologous) HSR aktivitesini değerlendirmek için kullanılır9. Bu muhabirler çeşitli tedirginliklere yanıt olarak aktive yolları hızlı bir karakterizasyon sağlar.

Genellikle, burada sunulan muhabirler stres yanıtlarının aktivasyonu nitel bir çıkış sağlayan mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Ancak, görüntüleme teknikleri yukarıda açıklanan gazetecilerin yoğunluğu ve doku konumu hakkında hem bilgi sağlarken, onun nicelliği her zaman doğru veya sağlam değildir. Görüntüleme analiz araçları kullanılarak floresan aktivasyonu ölçmek mümkün olmakla birlikte, bu yöntemler nispeten düşük iş akışı ve örnek boyutu küçüktür, çünkü görüntülenmiş hayvan sayısı nispeten düşüktür. Kolaylık ve hayvanların büyük miktarlarda elde etmek için yeteneği hızla C. elegans ideal bir model sistemi büyük bir parçacık akışı sitometre kullanımı ile floresan stres muhabirlerinin aktivasyonunu titretmek için olun. Büyük parçacık akış sitometresi, birçok canlı hayvanın boyutuna ve floresansına göre kayıt, analiz ve sıralama yeteneğine sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, binlerce solucan için floresan yoğunluğu, boyutu ve mekansal (2D) bilgi almak mümkündür. Sistem flowpilot kullanılarak kontrol edilir, hangi gerçek zamanlı veri toplama ve ölçülen parametrelerin analizi sağlar. Burada, büyük parçacık akış sitometresi kullanarak hem mikroskobik görüntüleme hem de kantitatif analiz yöntemleri stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için yöntemler olarak sunulmuştur.

Muhabir analizinin ötesinde, hayvanların strese karşı duyarlılığı veya direnci fizyolojik stres tahlilleri kullanılarak ölçülebilir. Bu belirli hücresel stres yollarını etkinleştirmek stresli ortamlara hayvanların maruz kalma ile elde edilir. Burada, tüm hayvanların belirli stres türlerine karşı duyarlılığını ölçmek için çeşitli yöntemler sağlanmaktadır.

ER stres ilerkist asyon, n-bağlı glikozilasyon blokları, ER10yanlış katlanmış proteinlerin birikimine neden kimyasal ajan, tunicamycin kullanılarak C. elegans uygulanır. C. elegansolarak , ER fonksiyonunda majör pertüreasyonlar tunicamycin sonuçlarına maruz kalma üzerine büyüme, ve önemli ölçüde azalmış ömrü11. Tunicamisin içeren plakalar üzerinde hayvanların hayatta kalma ölçümü ile, hayvanların ER stres duyarlılığı ölçülebilir. Örneğin, ektopik UPRER indüksiyonu olan ve böylece ACIL’de protein misfolding strese karşı direnci artmış olan hayvanlar yabani tip hayvanlara göre tunicamycin maruz kalma üzerine artan bir sağkalım var12.

Oksidatif ve mitokondriyal stres C. elegans kimyasal ajan, paraquat hayvanlar maruz tarafından uygulanır. Paraquat özellikle mitokondri13süperoksit oluşumuna neden olan yaygın olarak kullanılan herbisit vardır. Mitokondri kaynaklı reaktif oksijen türlerinin (ROS) spesifik lokalizasyonu nedeniyle, paraquat tahlilleri genellikle “mitokondriyal” stres tahlilleri olarak kullanılır. Ancak, süperoksit hızla mitokondriyal süperoksit dismutazlar tarafından hidrojen peroksit dönüştürülür (SODs)14. Hidrojen peroksit daha sonra mitokondri dışına yayılabilir ve hücrenin diğer bölümlerinde oksidatif strese neden olabilir. Bu nedenle, paraquat sağkalım tahlilleri hem mitokondriyal hem de oksidatif strese duyarlılık ölçümü olarak tanımlarız (diğer oksidatif stres tahlilleribulunabilir 15).

Termotolerans tahlilleri C. elegans yüksek sıcaklıklarda hayvanlar yerleştirerek yapılır. Nematodlar için ortam sıcaklıkları ~15-20 °C’dir ve termal gerilim 25 °C16,17üzerindeki sıcaklıklarda indüklenir. Termotolerans tahlilleri genellikle 30-37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yapılır, hayvanlar bu sıcaklıkta büyük hücresel bozukluklar sergilerler ve hayatta kalma tahlilleri 24 saat içinde tamamlanır16,18. Burada termotolerans tahlillerinin icrası için iki alternatif yöntem sağlanmaktadır: 34 °C’de büyüme ve 37 °C’de büyüme. Burada sunulan protokoller birlikte, RNA paraziti veya kimyasal ilaç kütüphaneleri kullanılarak standart gen knock-down ile birleştirildiğinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Protokol, C. eleganların büyümesi ve görüntülemeye hazırlık (bölüm 1 ve 2), transkripsiyonel muhabirlerin floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmesi (bölüm 3-5), büyük parçacık akış sitometresi kullanan muhabirlerin kantitatif ölçümleri (bölüm 6) ve C. elegans’taki stres hassasiyetini ölçmek için fizyolojik tahliller olmak üzere 4 geniş prosedüre bölünebilir (bölüm 7).

Protocol

1. Standart sıcaklık ve OP50 vs HT115 büyüme koşulları Standart büyüme ve genişleme LB(Tablo 1)veya ortam sıcaklığında (~22-25 °C) 24-48 saat için tercih edilen eşdeğer ortamda OP50 kültürünü büyütün. OP50 bir urasil auxotroph olduğu için oda sıcaklığında bakteri yetiştirmek ve 37 °C’de yetiştirildiğinde daha yüksek bir geri revertant (örn. baskılayıcı mutantlar) insidansı vardır. OP50 kültürlerinin uzun süreli depolanması önerilmez (4 °C’d…

Representative Results

Stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için transkripsiyonel muhabirleri kullanmaBurada, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılır, Hangi C. elegansen stres yanıtlarının aktivasyon ölçmek için sağlam araçlar olarak hizmet vermektedir. GFP ifadesi, bölmeye özgü streslere yanıt veren ana transkripsiyonel düzenleyicilerin kanonik hedeflerinin organizatörü altında yürütülür. Yaygın olarak kullanılan transkripsiyonel muhabirler…

Discussion

Burada, C. eleganshücresel stres yanıtlarını sorgulamak için yöntemler , floresan transkripsiyonel muhabirler ve fizyolojik stres sağkalım tahlilleri kullanılarak açıklanmıştır. Muhabirlerin hepsi, hücresel stres tepkilerinin artmasıyla ilgili transkripsiyon faktörlerinin aşağı transkripsiyon hedefinin organizatörü altında yönlendirilen GFP ifadesini kullanırlar. HSP-4p kullanımı::GFP XBP-1s-aracılı UPRERtarafından modüle , hsp-6p::GFP ATFS-1-aracılı …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.BZ. EMBO uzun vadeli burs ve Larry L. Hillblom Vakfı tarafından desteklenir. R.H.S, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) ve Glenn Tıbbi Araştırma Doktora Sonrası Burs Vakfı aracılığıyla 5F32AG032023-02 hibe ile desteklenir. A.F. NIA aracılığıyla Hibe F32AG051355 tarafından desteklenir. H.K.G. Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu Programı ile DGE1752814 hibe ile desteklenir. M.G.M. NIA ile 1F31AG060660-01 tarafından desteklenir. A.D. Thomas ve Stacey Siebel Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve 4R01AG042679-04 ve 5R01AG05891-02 NIA ve 5R01ES021667-09 NIEHS tarafından desteklenir. Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet ve Anel Esquivel’e önemli teknik yardımlar için teşekkür ederiz. Biz Morimoto laboratuvar ve CGC (NIH Office Araştırma Altyapı Programı P40 OD010440 tarafından finanse edilen) suşları için teşekkür ederiz.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 for mitochondrial stress
Bacto Peptone Fisher Scientific DF0118072 for NGM plates
BD Difco granulated agar VWR 90000-782 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin BioPioneer C0051-25 for RNAi
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 for NGM plates
COPAS Biosorter Union Biometrica 350-5000-000 equipped with a 488 nm light source.
COPAS Cleaning Solution Union Biometrica 300-5072-000 to use with COPAS
COPAS Sheath Solution Union Biometrica 300-5070-100 to use with COPAS
DMSO Sigma-Aldrich 472301 solvent for drugs
IPTG dioxane free Denville Scientific CI8280-4 for RNAi
LB Broth Miller Fisher Scientific BP1426500 for LB
M205FA stereoscope Leica 10450040 equipped with a Leica DFC3000G monochromatic CCD camera, standard Leica GFP filter (ex 395-455, EM 480 LP), and LAS X software
Magnesium sulfate heptahydrate VWR EM-MX0070-3 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride Fisher P217-500 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
Revolve ECHO 75990-514 equipped with an Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objective lens, standard Olympus FITC filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560), and an iPad Pro for camera and to drive ECHO software
Sodium Azide Sigma-Aldrich 71289-50G for imaging
Sodium Chloride EMD Millipore SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tert-butyl hydroperoxide Sigma-Aldrich 458139 for oxidative stress
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011 (2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. 생화학. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. 암 연구학. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. 유전학. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37 (2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792 (2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762 (2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466 (2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701 (2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177 (2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Tags

C. ElegansPhysiological Stress ResponsesStress Response AssayHeat Shock ProteinEndoplasmic Reticulum Unfolded Protein ResponseGFP ReporterSodium AzideMicromanipulationHigh-throughputGenetic PerturbationsPharmacological PerturbationsMolecular And Physiological AnalysisSynchronizationImagingMicroscopy
check_url/kr/61001?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bar-Ziv, R., Frakes, A. E., Higuchi-Sanabria, R., Bolas, T., Frankino, P. A., Gildea, H. K., Metcalf, M. G., Dillin, A. Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans. J. Vis. Exp. (159), e61001, doi:10.3791/61001 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image