Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.
Abstract
Células musculares estriadas são indispensáveis para a atividade de humanos e animais. As fibras musculares únicas são compostas por miofibrils, que consistem em sarcomeres serialmente ligados, as menores unidades contratuais em músculos. A disfunção sarérica contribui para a fraqueza muscular em pacientes com mutações em genes codificando proteínas sarcomericas. O estudo da mecânica miofibril permite a avaliação das interações actin-myosin sem potenciais efeitos de confusão de miofibrils danificados e adjacentes ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas. Danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a falta de comprometimento. Se houver danos estruturais nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante o procedimento de isolamento ou durante o experimento. Além disso, estudos em miofibrils fornecem a avaliação das interações actin-myosin na presença das restrições geométricas dos sarcomeres. Por exemplo, medições em miofibrils podem elucidar se a disfunção miofibrilar é o efeito primário de uma mutação em uma proteína sarcomeric. Além disso, a perfusão com soluções ou compostos de cálcio é quase instantânea devido ao pequeno diâmetro do miofibril. Isso torna os myofibrils eminentemente adequados para medir as taxas de ativação e relaxamento durante a produção de força. O protocolo descrito neste artigo emprega uma sonda de força óptica baseada no princípio de um interferômetro Fabry-Pérot capaz de medir forças na faixa nano-Newton, acoplado a um motor de comprimento piezo e um sistema de perfusão de passo rápido. Esta configuração permite o estudo da mecânica miofibril com medições de força de alta resolução.
Introduction
As células musculares estriadas são indispensáveis para as atividades cotidianas. O movimento dos membros, a função respiratória e o movimento de bombeamento do coração dependem da força gerada pelas células musculares. O músculo esquelético consiste em fascicles musculares contendo feixes de fibras musculares únicas(Figura 1A). Estas fibras musculares são compostas por miofibrils, que são formados por sarcomeres serialmente ligados(Figura 1B,D). Os sarcomeres contêm filamentos finos e grossos. Estes consistem principalmente em cadeias de moléculas de actina e miosina, respectivamente(Figura 1B). As interações actina-miosina são responsáveis pela capacidade de geração de força dos músculos. Pacientes com mutações em genes codificados por proteínas sarcomericas, como nebulina, actina e troponina T, sofrem de fraqueza muscular devido à disfunção contratil1.
A qualidade da contratilidade muscular pode ser estudada em vários níveis de organização, desde músculos inteiros in vivo até interações actin-myosin em ensaios de motilidade in vitro. Durante as últimas décadas, vários grupos de pesquisa desenvolveram configurações para determinar a contralidade dos myofibrils individuais2,3,4,5,6,7,8,,9,10. Essas configurações baseiam-se na detecção de alterações na deflexão a laser de um cantilever (ou seja, deflexão óptica do feixe) causada pela contração do myofibril (para detalhes, consulte Labuda et al.11). Embora a determinação da função contratual dos myofibrils tenha algumas limitações (por exemplo, a dinâmica dos processos de acoplamento excitação-contração que estão a montante dos miofibrils são escassas), há múltiplas vantagens nessa abordagem. Estes incluem: 1) a capacidade de avaliar interações actina-miosina na presença das restrições geométricas dos sarcomeres; 2) a capacidade de avaliar as interações actina-miosina sem potenciais efeitos confusos de miofibrils danificados e adjacentes (ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a contratilidade prejudicada) (Figura 1D); 3) o pequeno diâmetro dos miofibrils (~1 μm, Figura 2A) e a falta de membranas permitem uma difusão de cálcio quase instantânea nos sarcomeres. Além disso, se os danos estruturais estiverem presentes nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante seu isolamento ou durante o experimento. Assim, avaliar a contratude do miofibril é um método elegante para estudar os mecanismos básicos de contração muscular e entender se as interações actina-miosina perturbada são a principal causa de doença muscular causada por mutações em proteínas sarcomericas.
Este protocolo apresenta uma configuração recém-desenvolvida para determinar a contratilidade dos myofibrils incorporando uma sonda de força cantilever com resolução nano-Newton (ou seja, Optiforce). Esta sonda de força é baseada no princípio da interferometria. A interferometria permite o uso de cantilevers relativamente rígidos. Isso torna possível medir a força com pouca deflexão do cantilever, aproximando-se de contrações isométricas do miofibril. A sonda permite a avaliação de forças passivas e ativas baixas que são produzidas por um único myofibril isolado de diferentes biópsias musculares, incluindo as de indivíduos humanos, com uma alta relação sinal-ruído. A sonda óptica cantilever force incorporada nesta configuração é baseada em um interferômetro Fabry-Pérot12. O interferômetro detecta pequenos deslocamentos entre uma fibra óptica e um cantilever revestido de ouro montado em uma ferrule(Figura 3). A distância entre a fibra óptica e o cantilever é chamada de cavidade Fabry-Pérot. Os myofibrils são montados entre a sonda e o motor piezo usando duas fibras de montagem de vidro revestidas de cola. A força produzida pelo myofibril pode ser matematicamente derivada dos dados do interferômetro. A interferometria é baseada na superposição ou interferência de duas ou mais ondas (nesta configuração três ondas de luz). A luz laser com comprimento de onda entre 1.528,77-1.563,85 nm é emitida a partir do interferômetro e é enviada através da fibra óptica. Na sonda, a luz é refletida 1) na interface entre a fibra óptica e o meio(Figura 3A); 2) na interface do meio e do cantilever(Figura 3B); e 3) na interface entre o revestimento metálico e dourado do cantilever(Figura 3C). A reflexão na interface A e B depende do índice de refração (n)do meio em que a sonda está submersa. A luz, composta pelas três reflexões sobrepostas, retorna a um fotodiodo no interferômetro. O fotodiodo mede a intensidade da luz, que é o resultado do padrão de interferência das três reflexões sobrepostas. Quando a força contratil é gerada ativando ou esticando um myofibril, o myofibril puxa o cantilever. Esse movimento altera o tamanho da cavidade (d) e, consequentemente, o número de comprimentos de onda que se encaixam na cavidade. A luz refletida no cantilever terá uma fase diferente, resultando em um padrão de interferência diferente. O fotodiodo registra essa mudança de intensidade de padrão de interferência como uma mudança em Volts. Posteriormente, a geração de força myofibril é calculada a partir desta mudança, levando em conta a rigidez cantilever. A sonda de força é calibrada pelo fabricante empurrando a ponta da agulha de montagem, presa à extremidade de entrega livre do cantilever, contra uma balança de pesagem, mantendo a dobra do cantilever igual a um múltiplo do comprimento de onda do laser de leitura13. Assim, a interferometria é um método altamente sensível para detectar pequenas alterações à distância, permitindo a medição de forças com resolução nano-Newton. Esta resolução permite a avaliação da produção de força miofibrilar com uma alta relação sinal-ruído. Enquanto a interferometria tradicional limita a faixa de medidas à parte linear da curva de interferência, o uso de um amplificador de travamento e modulação do comprimento de onda laser supera essa limitação14. Isso é explicado com mais detalhes na seção de discussão.
Para medir a tensão ativa do miofibril, um sistema de perfusão de passo rápido foi incorporado para expor o miofibril às soluções de cálcio(Figura 4A). O sistema de perfusão de passo rápido permite que mudanças de solução ocorram dentro de 10 ms. Devido ao seu pequeno diâmetro, a difusão de cálcio nos miofibrils é quase instantânea. Assim, este sistema é particularmente adequado para medir as taxas de ligação actin-myosin durante a ativação e liberação durante o relaxamento. A taxa de ativação (kACT) e relaxamento (kREL) podem ser determinadas a partir das curvas de ativação-relaxamento. Além disso, expondo os miofibrils a soluções de cálcio de concentração crescente, a relação força-cálcio e a sensibilidade ao cálcio podem ser determinadas.
Além disso, um motor de comprimento piezo permite alongamento rápido e encurtamento do myofibril. Isso oferece a possibilidade de estudar as propriedades viscoelásticas (ou seja, tensão passiva) do myofibril, bem como realizar um rápido encurtamento e ressuado do miofibril para determinar a taxa de reurbanização da tensão (kTR). Os parâmetros recuperados de experimentos de tensão ativa e passiva podem ser alterados por mutações genéticas em uma proteína sarcomeric.
Esta configuração personalizada foi usada para medir as características contratuais ativas e passivas de myofibrils isolados de músculos esqueléticos humanos, pacientes e camundongos saudáveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito é um protocolo para avaliar a função conctítil de miofibrils isolados dos tecidos musculares esqueléticos humanos ou animais. A resolução de força desta configuração foi descrita anteriormente por Chavan et al.12. Em suma, é determinado pelas flutuações aleatórias do comprimento da cavidade Fabry-Pérot formada entre a fibra de detecção e o cantilever, que produzem a parte dominante do ruído na saída da leitura (expressa em V) que, multiplicada pela sensibilidade de defl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado pela AFM-Telethon e uma Fundação Construindo Força para Miopatias Nemaline. Os autores desejam reconhecer o criador dos produtos mencionados neste artigo, IONOptix Inc.
Materials
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
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