Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM
Summary
Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l’analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.
Abstract
Poiché la funzione cellulare è influenzata da fattori specifici della nicchia nel microambiente cellulare, i metodi per sezionare la localizzazione e la migrazione delle cellule possono fornire ulteriori informazioni sulla funzione cellulare. Le cellule B-1a sono un sottoinsieme di cellule B univoco nei topi che producono anticorpi IgM naturali protettivi contro gli epitopi specifici dell’ossidazione che sorgono durante la salute e la malattia. La produzione di IgM a cellule B-1a varia a seconda della posizione delle cellule B-1a, e quindi diventa utile da un punto di vista terapeutico indirizzare la localizzazione B-1a a nicchie a sostegno della produzione di anticorpi ad alta. Qui descriviamo un metodo per indirizzare la migrazione delle cellule B-1a al midollo osseo per sovraespressione retrovirale del recettore chemiochina C-X-C 4 (CXCR4). L’induzione genica nelle cellule murine B primarie può essere difficile e in genere produce basse efficienze di trasfezione del 10-20% a seconda della tecnica. Qui dimostriamo che la trasduzione retrovirale delle cellule murine B-1a primarie si traduce in un’efficienza di trasduzione del 30-40%. Questo metodo utilizza il trasferimento di cellule adottive di cellule B-1a trasdotte in topi destinatari carenti di cellule B in modo che sia possibile visualizzare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a del donatore B-1a. Questo protocollo può essere modificato per altri costrutti retrovirali e può essere utilizzato in diversi saggi funzionali di trasferimento post-adozione, compresa l’analisi della cellula donor o della funzione della cellula ospite, o l’analisi di fattori solubili secreti dopo il trasferimento di cellule B-1a. L’uso di distinti topi donatori e riceventi differenziati da allotipi CD45.1 e CD45.2 e la presenza di un reporter GFP all’interno del plasmide retrovirale potrebbero anche consentire il rilevamento di cellule donatrici in altri modelli murini immunosufficienti contenenti popolazioni di cellule B endogene.
Introduction
Recenti studi hanno dimostrato una notevole cellula immunitaria, e in particolare cellule B, fenotipica e eterogeneità funzionale a seconda della localizzazione cellulare1,2,3,4,5. Le cellule B-1a sono una di queste popolazioni con capacità eterogenea di produrre anticorpi IgM protettivi; Le cellule del midollo osseo B-1a secernono IgM in modo costitutivo e contribuiscono in modo significativo al plasma IgM titers6, mentre le cellule peritoneali B-1a hanno una secrezione IgM di basso livello all’omeostasi e possono invece essere attivate attraverso il recettore innato del toll-like (TLR) o la segnalazione di citokine mediata a proliferare rapidamente, migrare, e secernere IgM7,8,9,10. Gli anticorpi IgM delle cellule B-1a riconoscono gli epitopi specifici dell’ossidazione (OSE) presenti su patogeni, cellule apoptotiche e LDL ossidati, e il legame IgM all’OSE possono prevenire la segnalazione a valle in malattie come l’aterosclerosi infiammatoria11. Pertanto, le strategie per aumentare la produzione di IgM attraverso l’aumento della migrazione cellulare B-1a peritoneale a siti come il midollo osseo possono essere terapeuticamente utili. Tuttavia, è importante che tali strategie siano mirate e specifiche del tipo di cellula, poiché gli effetti off-target possono avere un impatto negativo sulla funzione o sulla salute del sistema immunitario.
Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione mirata e a lungo termine di CXCR4 nelle cellule primarie murine B-1a e il successivo trasferimento adottivo per visualizzare la migrazione delle cellule e la produzione funzionale di anticorpi IgM (Figura 1). La manipolazione genetica delle cellule B primarie è limitata da basse efficienze di trasfezione rispetto alla trasfezione di linee cellulari trasformate. Tuttavia, poiché le linee cellulari trasformate possono deviare significativamente dalle cellule primarie12,13, è probabile che l’uso di cellule primarie fornisca risultati più strettamente allineati alla fisiologia normale. Sono state descritte diverse tecniche per il trasferimento genico nelle cellule primarie del murino B, tra cui trasduzione retrovirale, trasduzione adenovirale, lipofezione o trasfezione basata sull’elettroporazione, che hanno diversi livelli di efficienza, transitorietà e impatto sulla salute cellulare13,14,15. Il seguente metodo ha utilizzato la trasduzione retrovirale in quanto ha prodotto un’adeguata efficienza di trasferimento genico di >30%, con un impatto minimo sulla vitalità cellulare. Il retrovirus espresso CXCR4 è stato generato utilizzando il costrutto retrovirale descritto in precedenza per il virus della cellula staminale murine, l’ingresso interno del sito-proteina fluorescente verde (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in cui il gene CXCR4 del topo era sub-clonato4. Le particelle retrovirali MigR1 (control(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP sono state generate utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio, come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza4,14.
Le cellule B-1a trasdotte con successo sono state poi trasferite per via endovenosa nei topi Rag1-/-mitragliati carenti di linfocite. Sia i topi donatori che quelli riceventi contenevano inoltre l’eliminazione del gene dell’apolipoproteina E (ApoE), che si traduce in un aumento dell’accumulo di OSE e dell’aterosclerosi, fornendo così un modello per l’attivazione cellulare B-1 in vivo e la produzione di IgM. Inoltre, i topi donatori e ricittori differivano nell’allotipo CD45; Le cellule del donatore B-1 provenivano datopi CD45.1 e sono stati trasferiti neidestinatari Rag1-/- CD45.2. Ciò ha permesso la differenziazione del donatore CD45.1 dalle cellule CD45.2 B del ricevente dopo il trasferimento senza la necessità di macchiare ulteriormente i marcatori di cellule B durante l’analisi della citometria di flusso. I risultati forniti qui dimostrano che la sovraespressione mirata di CXCR4 sulle cellule B-1a si associa alla maggiore capacità delle cellule B-1a di migrare verso il midollo osseo, che associa a un aumento del plasma anti-OSE IgM. Forniamo inoltre un metodo per l’arricchimento delle cellule B-1 peritoneali attraverso la selezione negativa e dimostriamo il requisito dell’attivazione delle cellule B-1 per una trasduzione efficiente. Questo metodo può essere adattato per altri costrutti retrovirali per studiare l’effetto della sovraespressione proteica sulla migrazione, sul fenotipo o sulla funzione delle cellule B-1a. Inoltre, l’uso della distinzione di allotipo CD45.1 rispetto a CD45.2 potrebbe teoricamente consentire il trasferimento in altri modelli murini immunosufficienti contenenti cellule B endogene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui fornito consente la somministrazione stabile e relativamente efficiente del gene delle cellule B-1a primarie, il trasferimento adottivo in vivo e l’identificazione e localizzazione delle cellule iniettate. Le cellule sono state in grado di essere rilevate 17 settimane di trasferimento post-cella e mantenuto una maggiore espressione CXCR4. La consegna mediata da retrovirus ha prodotto un’efficienza di trasduzione del 30-40% delle cellule primarie del murino B-1a con un impatto minimo sulla vitalità cellular…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 di P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) e R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye è stato supportato dalla borsa di studio pre-dottorato dell’American Heart Association 16PRE30300002 e 5T32AI007496-20. Ringraziamo Joanne Lannigan, Mike Solga e Claude Chew dell’University of Virginia Flow Cytometry Core per la loro eccellente assistenza tecnica.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
